亚硝胺类物质是近来在美国、加拿大以及中国等地区的饮用水中广泛检出的一种新的氯胺化消毒副产物^[1,2,3], 会引起肝、肺功能的损伤^[4], 美国环保署 (USEPA) 和世界卫生组织 (WHO) 已将一系列的亚硝胺类物质列入候选污染物清单中, 我国也已经开始了这方面的研究。二甲基亚硝胺 (NDMA) 是在饮用水处理系统中较为常见的含氮类消毒副产物^[5,6,7], 检测浓度通常在0~600ng/L之间, 被国际癌症研究中心 (IARC) 列为疑似致癌物之一。

　　 水源水以及饮用水中NDMA的量在纳克 (ng/L) 级, 通常的检测方法是用液液萃取或者固相萃取法对待测物进行富集和浓缩, 然后利用色谱将分析物与杂质分离, 再利用两级质谱进行检测以达到定量的目的。超高效液相色谱 (HPLC) 测定参数灵活, 能检测出热稳定性较差和高沸点的亚硝胺类物质^[8,9,10]。目前国内尚没有液质联用检测NDMA的标准方法, 曾有学者尝试使用ESI作为离子源进行测定方法研究^[11], 但至今尚未见采用APCI源成功测定的报道。本文提出和建立了以APCI作为离子源的SPE-HPLC-MS/MS的实验室新方法, 适用于水中ng/L级NDMA浓度的检测。

　　 甲醇 (色谱纯) 、乙腈 (色谱纯) 、二氯甲烷 (色谱纯) 购于J.T.Baker (美国) ;7种亚硝胺类标准品:分析标准品、甲酸 (色谱纯) 和磷酸盐缓冲溶液购于Sigma-Aldrich (美国) ;NDMA-d6氘代标准品购于德国LGC公司;高纯氮气 (含量>99.999%) 。

　　 将亚硝胺混合标准液和内标标准液用色谱纯乙腈分别配制成1mg/L的母液, -20℃冰箱保存。

　　 采用Agilent1290uHPLC超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱系统配APCI源, 包括二元泵, 自动进样器、真空在线脱气机和柱温箱、MassHunter工作站;Poroshell 120SB-AQ C18色谱柱 (4.6mm×50mm, 粒径2.7μm) ;全自动固相萃取仪 (Thermal Fisher) ;固相萃取支架 (Supelco SPE Vaccum Mainfold-DL, 12-port model) ;超纯水机 (美国Millipore Mill-Q) ;台式pH计 (Mettler Toledo FE 20K) 。

　　 试验水样采集自上海某水源地水源水和上海某水厂的出厂水, 采样瓶为5L的带盖玻璃瓶。水源水含有较多的杂质会对富集以及后续的测定产生影响^[8], 在进样之前需要用沸煮过的0.45μm醋酸纤维膜滤去悬浮固体杂质, 然后用磷酸盐缓冲溶液将水样pH调节到8。

　　 采用固相萃取法对水样进行浓缩和富集, 选用椰壳活性炭萃取小柱 (1 000mg/6mL) , 上样之前, 先依次用10mL色谱纯二氯甲烷、15mL色谱纯甲醇以及15mL的超纯水淋洗萃取小柱, 以去除柱内的杂质并创造一定的溶剂环境;加入20μL的内标母液, 用全自动固相萃取装置来完成上样, 上样量设为400mL, 流速为5 mL/min。进样完成后, 使用10mL二氯甲烷对待测物进行洗脱, 洗脱完成后在常温下用缓慢氮气流吹拂液体表面, 再用超纯水将萃取物定容至1mL。

　　 采用梯度进样的方式, 流动相由0.1%甲酸水溶液A和0.1%甲酸乙腈溶液B组成, 对亚硝胺类物质进行分离。采用标准进样方式, 流动相梯度为:5%A保持1 min, 随后A的比例在2 min内升至50%, 在3.5min内升至80%, 在0.5min内提升至95%, 保持1min, 最后A的比例在0.05 min内降至5%并保持1.95min, 整个程序共10min, 前6分钟用于待测组分的分离, 之后分别用95%流动相A和95%流动相B冲洗色谱柱各2min使之平衡。

　　 对1~50μg/L标准待测物溶液进行测定, 以20μg/L标准品为例, 采用APCI正离子模式, 用多重反应监测 (MRM) 确认待测物的定量、定性前级离子和碰撞电压, 并确定产物离子及最佳碰撞能量。高响应强度、高m/z的离子碎片被用作定量离子, 次相应强度的离子被用作定性离子, 如表1所示。

　　 ESI源属于浓度敏感型离子化技术, 即样品先带电再喷雾, 带电液滴去溶剂化之后形成样品离子从而被检测, 浓度越高, 灵敏度越高, 适合中等极性到极性的大分子;检测中发现使用ESI源对标准品离子化时, NDMA在MRM模式下的信噪比小于3, 表明样品中的NDMA较难被ESI源离子化^[9]。APCI源-大气压化学电离离子源是在常压下的气态化学电离过程, 是ESI电离的一种有效补充。溶剂和反应气在电晕针作用下先带电, 再把电荷转移给化合物形成离子^[10,12]。采用APCI正离子模式可以很好地将NDMA离子化。

　　 在多重反应监测 (MRM) 检测条件下, 采用APCI正离子模式进行全扫描。对母离子、子离子、碰撞电压、碰撞能量、解簇电压等参数分别进行优化。将亚硝胺标准物质以超纯水作为溶剂定容到1mL, 配制浓度为1~50μg/L的亚硝胺标准溶液, 以标准进样的方式进样, 对离子源温度、雾化气流量、干燥气流量等参数进行优化, 质谱条件如表2所示。

　　 质谱条件优化之后, 在液相条件中, 选择梯度洗脱的方式对待测组分进行分离, 乙腈和水都是常见的流动相, 以0.1%的体积比添加甲酸, 进样量设定为20μL, 流速为0.5mL/min, 在该条件下, 标准样品中的7种亚硝胺取得了很好的分离效果, MRM监测条件下的NDMA等7种化合物的总离子色谱如图1所示。NDMA和NDMA-d6的总离子色谱如图2所示, NDMA子离子的保留时间为1.928min, NDMA-d6的保留时间为1.895 min。应用HPLC-MS/MS方法在10min内将亚硝胺标准溶液中7种亚硝胺类物质分离。

　　 用纯水将NDMA标准溶液配置成为梯度为1μg/L, 2.5μg/L, 5μg/L, 10μg/L, 20μg/L, 50μg/L的标准系列溶液, 并分别加入NDMA-d650μg/L。按照浓度从小到大的顺序, 使用HPLC-MS/MS在MRM模式下分别测定NDMA的浓度, 以NDMA与NDMA-d6的质量浓度比为横坐标, 峰面积比为纵坐标, 利用MassHunter工作站中的定量分析软件 (QQQ Quantitative) 绘制标准曲线, 如图3所示, 得出的相关性系数R²值为0.999 6, 线性相关性良好。

　　 水中通常含有的其他物质会对回收率产生影响, 需要进行清洗、富集洗脱以及浓缩等一系列的预处理以满足检测的要求。本研究选择椰壳活性炭作为填料。为了研究基质效应对回收率的影响, 取水源水、出厂水以及纯水进行加标回收率比对试验。依次以25ng/L和125ng/L的浓度将母液标准品加入到3种水样中, 检测浓度水平, 将测定值与标准曲线进行比较。从图4结果来看, 在加标量相同的情况下, 水源水的回收率要略低于出厂水和纯水, 这是因为基质效应会对椰壳活性炭的吸附过程产生一定的影响, 从而降低了NDMA的回收率。但不论对低浓度还是较高浓度的NDMA, SPE对3种水样处理的回收率均在80%以上, 证明基质效应对回收率的干扰还是较小的。处理浓度较高水样 (125ng/L) 时的回收率要高于浓缩浓度较低 (25ng/L) 时的水样, 这是因为浓度很接近检测限时, 定量的误差会增大, 从而影响回收率的计算值。

　　 向水源水、出厂水、纯水中分别添加5ng/L、25ng/L和50ng/L 3种浓度的NDMA标样, 每个样品重复测定7次, 计算相对标准偏差。如表3所示, 样品多次测定的相对标准偏差随着浓度的升高而降低, 接近检测限的低浓度 (2.5ng/L) 样品, 其相对标准偏差较大, 但小于10%;中间浓度或高浓度的样品, 其多次检测的相对标准偏差较小。因此, 加入5ng/L、25ng/L和50ng/L 3种浓度不同的亚硝胺标准溶液后, 加标样品测定结果的重复性均良好。

　　 按照样品分析的步骤, 对浓度为预估方法检测限2~5倍的样品 (1μg/L) 进行n≥7次的测定。测定浓度为1μg/L、5μg/L时标准样品7次, 并计算相对标准偏差, 则方法检测限如式1所示。

　　 式中MDL———方法检出限;

　　 n———样品测定次数;

　　 t———自由度为n-1, 置信区间为99%时的t分布;

　　 RSD———相对标准偏差。

　　 又因为浓缩倍数为400, 再将MDL除以浓缩倍数得出最终的方法检出限为1.12~3.11ng/L。

　　 为了研究水源水以及出厂水中NDMA浓度随季节变化规律, 在2015年12月、2016年3月、2016年5月以及2016年8月4个时间分别采集水样进行NDMA的测定。如图5所示, 水源水中未检测到NDMA (小于检测限) , 出厂水一年四季的NDMA浓度变化并不明显, 浓度水平10.65~12.02ng/L, 出厂水的NDMA含量与消毒前NDMA前体物质有关, 水厂高密度澄清池投加的聚丙烯酰胺类 (PAM) 物质可能与出厂水中生成NDMA有关^[13], 课题组正在开展PAM投加与NDMA生成之间的关系研究。

　　 (1) 采用Agilent 1290uHPLC串联Agilent6430QQQ质谱系统, 用大气压化学电离源、Poroshell120 SB-AQ色谱柱, 建立了HPLC-MS/MS (APCI源) 的NDMA测定方法。该方法可用于水中ng/L级NDMA的快速定性定量分析, 保留时间为1.928min。

　　 (2) 以纯水为定容溶剂, NDMA在1~50μg/L线性范围内, 相关系数R²>0.998。3种浓度水样测定结果的相对标准偏差均小于10%, 检测方法具有简便、灵敏度高和重复性好等特点。

　　 (3) 以椰壳活性炭作为固相萃取吸附剂, 确定了以色谱纯的二氯甲烷、甲醇和纯水对萃取柱进行活化, 选用二氯甲烷作为洗脱剂, 氮吹法吹脱的SPE方法。3种水样的加标回收率均在80%以上, 满足实际测定需求。

　　 (4) 通过该方法对上海某水源水以及出厂水的NDMA进行检测, 测得水源水的NDMA浓度低于检测限, 出厂水NDMA浓度水平随季节变化不大, 浓度为10.65~12.02 ng/L, 可能与PAM的投加有关。