抗生素的大量使用导致抗生素抗性基因 (Antibiotic Resistance Genes, ARGs) 在环境中广泛传播与扩散, 对公共健康、食品和饮用水安全构成极大威胁^[1]。近年来, 国内外有关ARGs的研究大多集中在来源和传播途径两方面, 对于ARGs控制方面的报道较少^[2]。据报道, 城市供水处理工艺去除ARGs能力有限, 管网水中ARGs的浓度甚至高于出厂水^[3,4]。由于管网管壁上会附着多种微生物, 逐渐形成生物膜, ARGs在运输过程中可能通过一些转移机制在不同细菌之间进行水平转移, 造成管网水在运输过程中产生ARGs的二次污染^[5]。因此, 管网水的ARGs污染和控制需要引起重点关注。

　　 紫外线 (Ultraviolet, UV) 是给水处理中广泛应用的消毒技术, 不仅对抗生素抗性细菌的灭活效果良好, 同时可以有效去除ARGs^[6]。目前关于UV消毒技术对ARGs去除效果的研究大多以水相样品为主, 鲜有关于对水相、生物膜相和颗粒物相中ARGs去除效果的比较。本文选取5种ARGs (ermA、ermB、ampC、aphA2和sulⅡ) 为研究对象, 采用低压紫外线 (Low Pessure-Ultraviolet, LP-UV) 对模拟给水管网系统中的水相 (进水和出水) 、生物膜相和颗粒物相样品进行不同剂量的辐照, 以实时荧光定量PCR确定不同相样品中每种ARGs的绝对浓度和相对浓度, 比较LP-UV辐照对模拟给水管网系统的不同相样品中5种ARGs的去除效果。

　　 本研究选取美国疾病预防与控制中心 (CDC) 研制的生物膜反应器来模拟给水管网系统 (见图1) ^[1]。CDC反应器由1L的玻璃容器组成, 内部安装24个PE材质挂片 (直径1.27cm, 厚度0.3cm) 用来模拟管道内壁, 挂片表面用于研究生物膜的附着生长情况。容器内部固定着1个搅拌器, 搅拌器转动给挂片提供一定的剪切力, 模拟实际给水管网的水力条件。搅拌器转速控制在200~300r/min, 保证剪切力均匀, 水力条件稳定。CDC反应器稳定运行2个月后收集样品进行检测。

　　 水相样品:采用Millipore滤膜 (直径90mm, 孔径0.22μm) 分别过滤进水和出水各20L, 在超净工作台中用刮刀刮取过滤后滤膜上的微生物菌群, 吸取15mL无菌水对刮刀和滤膜表面附着的微生物进行洗脱, 得到水相样品。

　　 生物膜相样品:取CDC反应器的6个挂片置于50mL离心管中, 加入15 mL无菌水, 涡旋振荡1min, 超声处理5 min, 重复振荡和超声处理各3次, 得到生物膜相样品。

　　 颗粒物相样品:采用Millipore滤膜 (直径47mm, 孔径1.2μm) 过滤出水50L, 过滤完毕取下滤膜放入50mL离心管内, 加入20mL无菌水, 涡旋振荡2min, 超声处理15min, 重复振荡和超声处理各2次, 得到颗粒物相样品。

　　 试验装置采用准平行光束仪。在不锈钢封闭腔体内安装一根功率为87 W的LP-UV灯管, 波长为254nm。腔体底部中央开口接一根长度可调节的不锈钢圆管 (直径9.3cm) , 其作用是产生平行紫外线使其能垂直到达样品的表面。紫外线平均强度由国际紫外线协会提供的计算表格得到^[8]。紫外线强度用UV-B型照度计 (北京师范大学光电仪器厂) 测定。

　　 将装有样品的玻璃培养皿置于准平行光束仪下, 放入转子用磁力搅拌器快速混匀, 进行不同剂量的辐照。辐照一定时间后, 关闭UV遮光板, 收集样品立即进行检测。辐照时间根据样品在254nm处的吸光度和辐照剂量 (10 mJ/cm²、20 mJ/cm²和40mJ/cm²) 来确定。

　　 余氯采用HACH 5870000便携式余氯测定仪测定;浊度采用HACH 1900C便携式浊度测定仪测定。

　　 采用GR-1 500A台式激光颗粒计数仪分析颗粒物浓度及粒径分布。

　　 吸取100μL的样品于96孔板中, 每个样品中加1μL的SYBR GREEN染料, 用移液枪吹打混匀。室温下孵育15min后, 放入多维高清流式细胞仪内 (BD LSRFortessa, USA) , 在488nm的单波长下进行分析, 以未加染料的样品做空白, 收集50μL样品进行细胞计数。每个样品设置5个平行样。

　　 对水相、生物膜相和颗粒物相样品进行LP-UV辐照后, 使用FastDNA Spin^Kit for Soil (MP Biomedical, USA) 试剂盒提取总DNA, 提取步骤按照说明书进行。

　　 根据文献总结, 选取水环境中常见的5种ARGs (ermA、ermB、ampC、aphA2和sulⅡ) 进行研究, 同时选取16S通用引物对ARGs的浓度进行相对定量。目的基因的信息见表1^[3,9,10]。

　　 荧光定量PCR标记方法使用SYBR Green I染料法, 检测使用LightCycler^96全自动荧光定量PCR系统 (Roche, USA) 。PCR试剂盒为FastStart Essential DNA Green Master (Roche, USA) 。反应体系为20μL, 具体如下:2×Master Mix, 10μL;正向引物F (10μM) , 1μL;反向引物R (10μM) , 1μL;模版DNA, 1μL;ddH₂O (PCR grade) , 7μL。

　　 反应程序:95℃预变性10min;95℃变性10s, 退火30s (退火温度见表1) , 72℃延伸30s (延伸时间根据目的基因片段大小适当调整, 一般按照片段bp数/10设定) , 共45个循环。融解曲线测定, 95℃变性10s;退火至50℃保温60s;反应结束结合融解曲线和PCR产物凝胶电泳检验是否有非特异性条带或者引物二聚体干扰试验结果。一般设定从55~95℃, 每隔0.5℃读取荧光值绘制融解曲线, 特异性扩增的特征峰一般在80~90℃, 据此判断非特异性扩增程度。

　　 ARGs的浓度可以用绝对浓度或者相对浓度表示。绝对浓度表示单位质量或者单位体积样品中ARGs的拷贝数 (如copies/g或者copies/L) ;相对浓度表示ARGs在16SrRNA基因中的比例, 没有量纲。因为样品预处理和提取DNA效率等多种因素造成的差异, 绝对浓度的误差往往较大, 而相对浓度则可以消除水样中不同微生物量所带来的偏差。因此, 本研究以ARGs的相对浓度进行结果分析。16SrRNA基因为细菌的保守区片段, 理论上可以用来指代生物量。

　　 ARGs相对浓度计算公式如式 (1) 所示:

　　 ARGs相对浓度=ARGs绝对浓度/16SrRNA基因绝对浓度 (1)

　　 ARGs去除率计算公式如式 (2) 所示:

　　 式中N₀———辐照前ARGs相对浓度;

　　 N———辐照后ARGs相对浓度。

　　 由表2看出, CDC反应器中微生物的生长会消耗氯, 导致出水余氯低于进水。出水的浊度、TCC和颗粒物浓度相较于进水明显升高, 这是由于CDC反应器挂片上最外层的生物膜脱落以及水中颗粒物等随着搅拌器转动呈悬浮状态所致。生物膜相TCC高于颗粒物相, 主要原因是管网水中颗粒物组分复杂, 微生物只占其中一部分, 虽然颗粒物可以吸附包裹一部分微生物^[11], 但是数量有限。此外, 进出水中颗粒物以直径2~7μm的小颗粒物为主, 分别占到进水和出水中颗粒物的70%和80%以上 (图2) 。

　　 CDC反应器水相 (进水和出水) 、生物膜相和颗粒物相中5种ARGs的相对浓度如表2所示, 红霉素类ARGs (ermA和ermB) 的相对浓度在出水中最高 (9.96×10^-2和2.31×10^-3) , 在颗粒物相中最低 (9.53×10^-6和2.70×10^-7) 。青霉素类ampC的相对浓度在出水中最高 (3.46×10^-2) , 在生物膜相中最低 (8.92×10^-4) 。氨基糖苷类aphA2的相对浓度在进水中最高 (4.45×10^-3) ;在生物膜相中最低 (1.37×10^-4) 。磺胺类sulⅡ的相对浓度在生物膜相中最高 (3.54×10^-2) , 在颗粒物相中最低 (2.85×10^-3) 。

　　 本研究结果表明, 5种ARGs在模拟给水管网系统的水相 (进水和出水) 、生物膜相和颗粒物相中均存在, 但是不同种类ARGs的相对浓度在不同相中略有差异。Chen等^[12]从饮用水中提取出抗红霉素类抗性细菌并检出红霉素类ermA和ermB。Shi等^[10]在自来水中发现ermA、ermB、ampC和aphA2, 其中ermA的相对浓度范围为0~10^-2, 其他3种抗性基因的相对浓度范围为0~10^-3;此外经管网运输后, ermA和ermB的相对浓度均有所升高。Guo等^[9]在2个饮用水处理厂的出水中均发现sulⅡ, 相对浓度范围分别为10^-3~10^-2和10^-2~10^-1。我国长三角流域两处水源中sulⅡ的相对浓度范围为10^-3.7~10^-2.6;对自来水中8种ARGs进行检测, 结果显示磺胺类ARGs浓度高于其他种类ARGs^[4]。本研究中水相样品 (进水和出水) ARGs污染与前期报道基本一致, 但未检测到磺胺类sulⅡ的相对浓度明显高于其他种类ARGs。

　　 如图3所示, LP-UV对CDC反应器水相 (进水和出水) 、生物膜相和颗粒物相中的5种ARGs均起到了去除效果, 并且去除率随LP-UV辐照剂量的增加而逐步提高。当LP-UV辐照剂量增加至40mJ/cm²时, 进水相中红霉素类ermA的去除率为5.59log;出水相中去除率为2.72log;生物膜相中去除率为2.91log;颗粒物相中去除率为1.83log。进水相中红霉素类ermB去除率为4.26log;出水相中去除率为4.32log;生物膜相中去除率为2.84log;颗粒物相中去除率为0.19log。对青霉素类ampC而言, 进水相中去除率为1.49log;出水相中去除率为2.06log;生物膜相中去除率为1.22log;颗粒物相中去除率为2.14log。对氨基糖苷类aphA2而言, 进水相中去除率为2.98log;出水相中去除率为1.73log;生物膜相中去除率为1.22log;颗粒物相去除率为2.60log。对磺胺类sulⅡ而言, 进水相中去除率为11.46log;出水相中去除率为9.51log;生物膜相中去除率为10.85log;颗粒物相中去除率为11.66log。

　　 在以前的报道中, Guo等^[13]研究发现红霉素类ARGs (ereA、ereB、ermA和ermB) 在5 mJ/cm²剂量的UV辐照后, 浓度明显降低, 当UV剂量大于10mJ/cm²时, 4种红霉素类ARGs浓度均在检测限以下;当LP-UV剂量为5mJ/cm²时, 污水中ermA和ermB的去除率分别达到96.7%和85.2%。郑吉等^[14]报道UV剂量为25 mJ/cm²时, sulⅠ和sulⅡ (琼氏不动杆菌) 的绝对浓度削减率分别为84.9%和89.9%;UV剂量为10 mJ/cm²时, 削减率分别为71.4%和60.0%。本研究中水相样品均为饮用水样品, 试验结果和前期报道基本一致, ARGs去除效果略好于前期污水样品。此外, 从图3可以看出, 相的种类对ARGs的去除效果具有一定影响。不同相之间具有统计学差异 (F=26.062, P=0.000) 。通过两两比较可知, 除生物膜相和出水相无统计学差异外 (P=0.429) , 其他相之间具有统计学差异 (P<0.05) , LP-UV对各相样品ARGs去除率的比较结果为进水相>出水相≈生物膜相>颗粒物相。说明LP-UV对模拟给水管网系统的出水相和生物膜相样品中的ARGs均有良好的去除效果。但是, 模拟给水管网系统的颗粒物相样品中由于物质组分复杂, 有些物质能够吸收LP-UV, 从而影响了ARGs对LP-UV的吸收, 导致ARGs的去除率低于其他相。

　　 本研究采用CDC反应器模拟给水管网系统, 选取5种ARGs (ermA、ermB、ampC、aphA2和sulⅡ) , 分析了它们在水相 (进水和出水) 、生物膜相和颗粒物相样品中的污染特征, 并研究LP-UV辐照对它们的去除效果。结果表明5种ARGs在模拟给水管网系统的水相 (进水和出水) 、生物膜相和颗粒物相中均有存在, 不同种类ARGs在各相样品中的相对浓度略有差异。LP-UV辐照对各相样品中ermA、ermB、ampC、aphA2和sulⅡ都有去除效果, 并且去除率随LP-UV辐照剂量的增加而逐步提高。此外, LP-UV对水相 (进水和出水) 和生物膜相样品中ARGs的去除率高于颗粒物相样品。LP-UV辐照对模拟给水管网系统中不同相界面的ARGs污染具有明显去除效果, 实际应用时可通过适当增加LP-UV辐照剂量以获得更高的去除率。