蓝藻暴发的次数、规模及危害有逐年加大的趋势,现今全国许多湖泊、水库已进入富营养化,甚至严重富营养化状态,如滇池、太湖、巢湖、三峡库区等^[1~3]。蓝藻在富营养的湖泊中可以快速生长,构成水华的蓝藻群体大量滋生后又大量地死亡,分解时散发出难以忍受的恶臭,严重污染水体和空气,同时大量消耗水中的溶解氧,常造成大批鱼类死亡。更为严重的是,有些蓝藻水体含有一种微囊藻类的毒素,具有强烈致癌作用,直接威胁人类的健康和生存^[4]。蓝藻水华已成为严重影响水环境质量的问题。

　　 铁在浮游植物光合作用、营养盐吸收利用中起着重要作用,是浮游植物生长过程中电子传递、氮的吸收利用、氧的新陈代谢、呼吸作用、光合作用的必要元素,藻类叶绿素的生物合成、对碳和氮的转移与同化作用以及藻细胞内生化组成比率的变化都受铁的影响^[5,6]。磷是海洋、湖泊等水生生态系统初级生产力水平的关键限制因素,磷是藻细胞核酸与膜的主要成分,也是三磷酸腺苷(ATP)的基本元素,对藻类的生长起着至关重要的作用^[7]。

　　 鉴于铁和磷元素在藻类生长中的重要作用,铁和磷两者对藻类种群密度演变所产生的协同作用是值得深入探讨的问题。Baken S^[8]的研究表明铁磷的胶体结合态会降低水体中的自由磷,同时也减少磷的生物利用度。Lehtoranta^[9]在波罗的海观测到铁的还原及铁和磷耦合循环会导致海域中磷浓度分布不同。翁焕新^[10]的研究得出藻细胞中铁含量与磷含量之间具有极显著的相关性。石鲁娜^[11]的研究得出不同浓度的铁影响着微囊藻对磷的吸收,高浓度铁抑制磷的吸收速率。刘海陆^[12]的研究得出磷和铁同时限制螺旋鱼腥藻的生长,当添加磷浓度大于0.02mg/L时,磷和铁之间存在交互作用。但磷铁协同作用,其协同浓度关系、协同机理、对不同藻种的作用异同等方面依然不清晰,所以近年来以磷铁为代表的常量-微量元素协同作用课题成为富藻水源预警领域的研究热点问题。

　　 水华鱼腥藻(Anabaena aquae)是华南地区常见的代表性蓝藻种属,具有固氮能力^[13,14]。本文以水华鱼腥藻作为研究对象,研究铁(微量元素)、磷(常量元素)对水华鱼腥藻增殖过程的影响。

　　 水华鱼腥藻Anabaena aquae FACHB-245:来自中国科学院淡水藻种库,与美国德州大学交换所得。藻种用BG-11^[15]进行培养。

　　 为了减少铁、磷污染,所用的玻璃器皿均在1mol/L HCl中浸泡1~2d,然后用蒸馏水冲洗,之后在KQ220型超声波清洗器中清洗15 min,再用蒸馏水冲洗干净在110℃下烘干。培养器皿在此基础上用LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器进行121 ℃高温高压灭菌30min后备用。

　　 配制缺铁、缺磷的BG-11 培养基,控制总氮浓度为40mg/L,用柠檬酸铁(FeC₆H₅O₇)配置铁贮备液,用磷酸二氢钾(KH₂PO₄)配置磷贮备液,按照试验设计初始条件添加到缺铁、缺磷的BG-11培养基中,成为AGP试验培养基。采用单因素试验,4 个水平的因子铁的含量(mg/L)为0.14、0.28、0.42、0.56;6 个水平的因子磷的含量(mg/L)为0.155、0.31、0.46、0.62、0.92、1.24。具体设计见表1。

　　 具体试验设置:用未删减营养元素的BG-11培养基做批次培养,到对数期时离心(6 000r/min,10min)收集细胞,缺铁、缺磷的BG-11培养基洗涤3次去铁、磷,最后用适量的缺铁、缺磷BG-11培养基重悬。 取少量重悬藻液作种源加入到装有200mL培养基的500mL锥形瓶中培养,接种浓度为1×10³个/mL。试验在恒温培养箱进行培养,光源为三基色荧光管,光照度为3 000lx,光暗比为12h∶12h,温度为25 ℃ ±1 ℃,pH为8.0±0.1。每天手动摇晃4次,减少器壁效应。培养期为20d,从接种第2天开始,每两天取样一次,15:00时刻定时取样,并随机更换锥形瓶位置。

　　 群体藻细胞在测定前先经过摇匀处理,尽量使群体分散。 用F96PRO型荧光分光光度计在657nm处测定光密度值。

　　 参照以下计算公式^[16]:

　　 式中C₀、C₁———分别为T₀和T₁时的细胞丰度;

　　 μ———平均生长率,d^-1;

　　 tg———世代时间,d。

　　 采用二氮杂菲分光光度法测定铁浓度,取2mL过滤后的藻液,加入盐酸和盐酸羟胺还原高价铁,再加入二氮杂菲溶液和乙酸铵缓冲溶液显色10min,后用T6型紫外分光光度计在510nm测定。

　　 采用钼酸铵分光光度法测定磷浓度,取2mL过滤后的藻液,加入过硫酸钾后进行121 ℃下高温高压消解30min,再加入抗坏血酸溶液和钼酸盐溶液显色15min,后用T6型紫外分光光度计在700nm测定。

　　 图1反映的是不同初始磷铁浓度对应的水华鱼腥藻培养20d所达到的生物量。可以看出:(1)在相同初始磷浓度下,20d藻生物量随着初始铁浓度不同而不同,变化趋势无明显规律;(2)在相同的初始铁浓度下,20d藻生物量随着初始磷浓度的不同而不同,也没有明显规律。以往的藻类营养盐的单因子试验研究表明,在富铁或富磷条件下,另一种元素就成为限制因子,随着浓度增加,对藻类的生长繁殖有明显的线性增长影响^[17,18]。

　　 由此进一步讨论认为,初始磷、铁含量对水华鱼腥藻的增殖过程均有影响,且与初始磷、铁含量的不同呈现不同的规律,磷铁对藻生物量的影响是协同作用。一方面,根据利贝格最小值定律,藻生物量峰值取决于最少的营养元素含量,因此富铁水体条件下,藻生长表现为磷限制,反之,富磷水体条件下,藻生长表现为铁限制;另一方面,作为微量元素铁,对藻的作用机理随着初始浓度的不同呈现“促进-限制”的交互作用,且不同的藻种的作用阈值范围不同。在这两种机制共同作用下,磷铁对水华鱼腥藻增殖的影响表现不再是单纯的线性关系作用,而是更为复杂,这从图1的数据点分布也可以看出。

　　 表2反映的是不同初始磷铁浓度下,水华鱼腥藻在20d生长过程中所吸收的磷量,可以看出不同初始铁浓度对磷的20d内吸收量影响不同。在P为0.155~0.62 mg/L浓度下,初始铁浓度差异造成的20 d磷吸收量的差异较小,而在P为0.92mg/L、1.24mg/L浓度下,初始铁浓度不同造成的差异较为明显,吸收量最大值与最小值的差值分别为0.27mg/L、0.19mg/L,占各自初始投加量的30%和16%。

　　 图2反映的是在不同初始铁浓度下,6 个磷浓度吸收磷量占初始磷含量的百分比平均值。从图中可以看出吸收磷的平均百分比从Fe=0.14 mg/L的91.3%一直下降至Fe=0.56 mg/L的84.0%,即随着初始铁浓度的增加,反而出现磷吸收平均百分比的下降。由此认为在试验铁浓度范围0.14~0.56mg/L内,初始铁浓度的升高不利于水华鱼腥藻吸收磷。尝试作以下分析:水环境中铁的存在形式会与磷的某种形态发生反应,从而降低水环境中藻可利用的磷浓度。自然水体中的铁盐不仅本身溶解度小,可利用率低,而且还会与磷酸盐生成沉淀,限制藻类对磷的利用^[19~21]。可交换态铁和碳酸盐结合态铁会与磷酸根阴离子发生络合或吸附反应。无定形的铁锰氧化物和水化氧化物结合的形态,一方面其具有较大的比表面积,可通过化学键形式与磷酸根在表面吸附位点键和,形成单基配位或双基配位^[22],降低磷的活性。另一方面该形态也易受环境条件变化的影响,当pH或氧化还原条件发生改变时,就会释放出Fe³⁺或Fe²⁺,与沉积物中的磷酸根阴离子进行作用^[23]。

　　 基于以上几种作用,作者认为在试验浓度范围内(天然水中常见铁、磷浓度范围),水中铁浓度的提高不利于水华鱼腥藻吸收利用水中的磷。这意味着如下两个结论:(1)当水中铁含量比较高的时候,会限制藻对常量元素磷的吸收,进一步影响藻生物量峰值和增殖速率;(2)水中铁对磷的吸收影响与磷铁的比例密切相关。

　　 再从综合角度比较,图3反映的是在不同初始磷浓度下,4个初始铁浓度下吸收磷量的百分比平均值。从图中可以看出吸收磷的平均百分比先从P=0.155mg/L的84.5%上升至P=0.46mg/L的97.8%,然后一直下降至P=1.24mg/L的64.6%。最大值出现在P=0.46 mg/L,第二大值为P=0.62mg/L处的95.7%,由此可以认为在水中铁介于0.14~0.56mg/L,初始磷介于0.46~0.62mg/L时,水华鱼腥藻对磷的吸收利用最充分。

　　 从图3中可以明显看出水华鱼腥藻吸收磷百分比并不是随着初始磷浓度的增加而呈现单纯的线性关系,考察不同铁磷比条件下,水华鱼腥藻对磷的吸收,结果如图4所示。图4反映了在不同铁磷比条件下,水华鱼腥藻20天内吸收的磷量。本试验样共计24个,不同铁磷比的试验样为14个,其中相同铁磷比的试验样做如下处理:取其算术平均值为该铁磷比对应的磷吸收量。

　　 从图4中可以看出,水华鱼腥藻的磷吸收量受铁磷比影响的整体趋势是先随着铁磷比的增大而增大,达到极大值点后随着铁磷比的增大而减小。尝试作以下分析:微量元素铁在藻增殖生长过程中具有不可替代的作用,吕秀平^[24]的研究表明微量元素铁对藻类生长有适宜浓度,超过上限值后会对藻产生抑制甚至毒害作用。图4中的曲线上升区间是由于铁浓度尚未达到适宜浓度,铁浓度的增加是促进作用;图4中的曲线下降区间是表明该区域中铁浓度对藻生长产生毒害作用,而且铁浓度越高,毒害作用越强。从图中趋势线可以看出,在初始铁浓度为0.14mg/L、0.28mg/L条件(相对低铁浓度范围)下,Fe/P约在0.51时出现极大值,水华鱼腥藻对磷的吸收利用可以达到98%;在0.42 mg/L、0.56mg/L条件(相对高铁浓度范围)下,Fe/P约在1.10时出现极大值,对磷的吸收利用约为94%。

　　 尝试作如下解释:藻类自身的增殖生长,需要按照自身构成元素的比例从环境中吸收相应比例的元素。根据严睿文^[25]研究表明巢湖中蓝藻细胞体内铁磷元素比例接近为0.24,这个比值与本试验中得出的0.51和1.10有所不同,作者认为主要是由于自然环境中可被生物利用的铁浓度低于水体中铁的浓度,因此环境中的铁磷比应该高于蓝藻细胞自身构成元素的铁磷比。由于在不同初始铁浓度下,铁对水华鱼腥藻的生长可能出现促进或抑制的复杂作用,影响对常量元素磷的吸收,因此造成相对低铁情况和相对高铁情况的Fe/P不同。

　　 图5反映的是不同铁磷比条件下,水华鱼腥藻平均生长率的变化。本试验样共计24个,不同铁磷比的试验样为14个,其中相同铁磷比的试验样做取其平均值为该铁磷比对应的磷吸收量的处理。

　　 从图5可以看出铁磷比对水华鱼腥藻生长速率有着重要的影响。平均生长率有两个极大值和两个极小值,分别为0.250d^-1、0.241d^-1和0.215d^-1、0.214d^-1,对应的铁磷比分别为0.30、1.22 和0.90、2.71。极大值与极小值呈周期性出现,推测认为当水华鱼腥藻对铁磷元素符合比例地吸收利用时具有较高生长率,更容易暴发藻华。第一个极大值对应的0.3接近蓝藻细胞自身的铁磷元素的构成比例,因此会具有高生长率,铁元素在极值前起促进作用,在极值后起毒害作用;认为铁磷比在0.9~1.2及2.71~3.61区间内,铁起促进作用。

　　 关注适宜藻类生长液的元素配比的研究^[26,27]发现,不同藻种适宜培养液对应的Fe/P不相同。笔者认为这与藻种本身的生物特征、磷铁吸收方式有关。结合图4中反映出不同浓度对应的Fe/P有所区别,营养盐的不同绝对浓度下,磷铁协同对藻类的影响极值不同。本试验结果显示环境处于适当铁磷比时有利于水华鱼腥藻快速生长,达到高生长率和小时代时间。综上所述,Fe/P可以作为一个类似N/P的指示指标,可以用于藻华预警技术,为预测藻华暴发所需时间提供支持。

　　 (1)在富磷富铁条件下,磷或铁对水华鱼腥藻增殖的影响表现是协同作用,初始磷、铁含量不同,增殖影响规律有显著差异。

　　 (2)水环境中磷铁浓度过高时会限制水华鱼腥藻对磷的充分吸收。 在铁浓度范围0.14 ~0.56mg/L内,初始铁浓度的升高不利于水华鱼腥藻吸收磷。磷的平均吸收百分比从Fe=0.14mg/L的91.3%一直下降至Fe=0.56mg/L的84.0%。在试验铁浓度范围内,初始磷介于0.46~0.62 mg/L时,水华鱼腥藻对磷的吸收利用最充分。

　　 (3)初始铁磷比对水华鱼腥藻吸收磷有着重要的影响,铁磷比对水华鱼腥藻利用磷的影响呈现先正相关后负相关的趋势,但具体极大值所在的Fe/P受初始铁浓度的制约,低铁(0.14~0.28 mg/L)浓度范围下Fe/P为0.51,高铁(0.42~0.56 mg/L)浓度范围下Fe/P为1.1。

　　 (4)在本试验条件下,Fe/P为0.3时水华鱼腥藻达到最大的平均生长速率。铁磷比是一个综合评价铁的促进、抑制作用和磷的限制作用的指示指标,可以为藻华暴发预警提供技术支持。