对BAF预处理低温水源水系统中硝化细菌的识别

作者：韩梅高伟崔福义

单位：北京市自来水集团技术研究院北京市供水水质工程技术研究中心哈尔滨工业大学市政环境工程学院住房和城乡建设部城乡规划管理中心住房和城乡建设部城镇水务管理办公室

摘要：生物处理工艺是解决水源水氨氮污染问题的主要途径, 但其功能菌属硝化细菌在工艺系统中受诸多因素影响, 尤其在低温期生物活性下降, 因此识别适应低温水环境的硝化细菌, 有利于为其构筑最适生长环境, 进而提升工艺降解氨氮的效果。以前期构建的悬浮填料-沸石曝气生物滤池为基础, 研究了经长期低温驯化后, 适应低温水环境的菌种及其演替。研究表明, 对曝气生物滤池系统中的硝化细菌按属、种进行分类, 主要的氨氧化细菌菌属是Nitrosomonas, 优势菌种为Nitrosomonas uncultured ammonia-oxidizing bacterium。就亚硝酸盐氧化细菌而言, 主要的菌属为Nitrospiraceae Nitrospira和Candidatus Nitrotoga, 其中Nitrospiraceae Nitrospira为硝化系统中常见菌属, Candidatus Nitrotoga是新型的、可以功能性替代Nitrospira的菌属, 更适在低温环境下生长;进一步将硝化细菌按种进行分类发现, 系统中亚硝酸盐氧化细菌的优势菌种为Nitrospiraunculturedbacterium、Nitrospira uncultured soil bacterium、Nitrospira sp.、Candidatus Nitrospira defluvii和Candidatus Nitrotoga uncultured bacterium。

关键词：氨氧化细菌亚硝酸盐氧化细菌曝气生物滤池低温氨氮

作者简介：韩梅, 通讯处:100012北京市朝阳区德外花虎沟水源九厂院内北京市自来水集团技术研究院E-mail:hithanmei@163.com;
基金：国家自然科学基金项目 (51508128);

0 引言

微生物的硝化作用是自然界整体氮循环的一部分, 自养硝化细菌在氧化氨氮的过程中分两步完成, 首先由氨氧化细菌将氨氮氧化成亚硝酸盐氮, 然后由亚硝酸盐氧化细菌将亚硝酸氮氧化成硝酸氮, 通常将氨氧化细菌 (AOB) 和亚硝酸盐氧化细菌 (NOB) 统称为硝化细菌^[1]。氨氧化细菌自1892年由Winogradsky^[2]首次成功分离后, 多种AOB菌株从自然环境或工程中被分离、培养, 基于细胞的形状和胞浆内膜的排列被普遍分为5个菌属, 其中亚硝化单胞菌属 (Nitrosomonas) 是目前发现包括氨氧化细菌菌种种类最多的菌属^[3,4]。具有氧化亚硝酸盐能力的硝化细菌被分为4类^[5,6], 即硝化杆菌属 (Nitrobacter) 、硝化螺旋菌属 (Nitrospira) , 硝化球菌属 (Nitrococcus) 和硝化刺菌属 (Nitrospina) 。在进化史上, 亚硝酸盐氧化细菌属于α-变形菌纲、γ-变形菌纲和 (暂时性) δ-变形菌纲^[7]。然而, 硝化细菌一直在不断地被发现中, Alawi等^[8]从永久冻土中富集、分离出一种属于β-变形菌纲的新型亚硝酸盐氧化细菌“Candidatus Nitrotoga arctica”, 随后在污水处理厂也富集到该菌属。

影响硝化细菌的因素很多, 尤其温度是影响天然硝化细菌多样性的主要因子^[9], Siripong和Rittmann^[10]对污水处理厂氨氧化细菌的研究表明, 硝化螺旋菌属和亚硝化单胞菌属的平衡变化归因于季节性温度的变化。Zhang等^[11]通过对饮用水生物预处理工艺的硝化细菌及其所在的生物膜系统特性的研究, 发现在2.8~28.3℃范围, 降低温度可明显降低硝化作用, 温度低于5℃时生物活性受到严重抑制。本研究以前期构建的悬浮填料-沸石曝气生物滤池^[12] (Suspended midea-zeolite biological aerated filter, 以下简称SZBAF) 为基础, 研究经长期低温驯化后, 系统内硝化细菌受温度影响菌种的演替, 并对适应低温环境生长的硝化细菌菌种进行识别。

1 试验方法

悬浮填料-沸石双层曝气生物滤池以松花江水为处理对象, 采用自然挂膜方式启动。上层沸石填料粒径1~3 mm, 堆密度1.35g/cm³, 孔隙率41.23%, BET比表面积4.85m²/g, 填充高度500mm, 用多孔滤板将上、下两层分开。下层聚乙烯悬浮填料呈柱状, 直径10mm, 堆密度150kg/m³, 填充率为80%, 底部呈流化状态 (见图1) 。系统在10~30℃温度范围内运行稳定后, 开始低温驯化, 低温期水温 (1.0~5.5℃) 通过低温恒温槽控制, 运行期间处理水量为2.38L/h, 气水比1∶1~2∶1, 通过适量向原水中投加硫酸铵调节进水氨氮浓度, 系统氨氮平均浓度为3.87mg/L。

图1 悬浮填料和沸石填料

为研究长期低温驯化过程系统填料表面硝化细菌的演替, 从SZBAF中取常温运行末低温驯化前样品 (沸石段命名为CW_FS、悬浮填料段命名为CW_QZ) 和低温驯化末期样品 (沸石段命名为DW_FS、悬浮填料段命名为DW_QZ) 做高通量测序分析, 测序工作委托美吉生物公司完成。

2 结果与讨论

温度对硝化细菌的生化反应速度具有显著的影响, 桑军强等^[13]采用生物陶粒曝气生物滤池处理官厅水库水源水, 研究表明水温从10℃下降到0.5℃时, 氨氮的去除率从90%下降到65%, 微生物活性随温度降低下降。但Chen S^[14]的研究表明硝化反应的最适温度是一个较宽的范围。Karkman等^[15]在用生物反应器处理无机矿产废水时发现, 温度从10℃降低到5℃, 硝化细菌的种类减少, 但Nitrosospira sp.和Candidatus Nitrotoga在低温环境下仍具有硝化作用。可见, 在满足硝化细菌溶解氧、底物充足和良好的水力条件下, 硝化细菌能够在较宽的环境温度下生长。本研究在1~5.5℃低温条件, 对SZBAF内硝化细菌的变化进行了分析。

SZBAF系统在长期的运行过程中, 主要的AOB是亚硝化单胞菌属 (Nitrosomonas) , 该菌属在低温和常温均存在, 但低温驯化使菌种的种类和数量发生明显的变化。如表1所示, 在低温驯化前, 系统内亚硝化单胞菌有3种, 且数量较少。经低温驯化后上层沸石段亚硝化单胞菌有14种, 序列数为100;下层悬浮填料段亚硝化单胞菌有16种, 序列数为68, 下层较上层多样性高, 两者的优势菌种一致, 分别是Nitrosomonas_oligotropha、Nitrosomonas_sp._Is79A3和Nitrosomonas_uncultured_ammonia-oxidizing_bacterium, 其中优势最大的菌种是Nitrosomonas_uncultured_ammonia-oxidizing_bacterium, 该菌种在常温和低温均存在, 但经低温驯化后数量骤增, 说明该细菌在低温水环境下生态位更具优势。

SZBAF系统内主要的亚硝酸盐氧化细菌菌属有两种, 分别为Candidatus_Nitrotoga和Nitrospiraceae_Nitrospira。对Candidatus_Nitrotoga分析表明, 该种菌属仅在低温期存在, 在常温期并未鉴定出, 说明该种菌属适宜在低温期环境下生长。Sebastian Lucker^[16]等对代表不同反应器类型的20个污水处理厂进行取样, 包括SBR、DIC-SBR和常规污泥处理系统, 经PCR扩增分析后表明有55%的样品中含有Candidatus_Nitrotoga, 且有趣的是, 这些能够使该细菌大量存在的污水处理厂运行温度均在7~16℃范围, 可见温度是该细菌生长的主要影响因子。研究表明, Candidatus_Nitrotoga能功能性地代替硝化螺旋细菌, 当这两个NOB集团共存时, Candidatus_Nitrotoga也能同Nitrospira竞争与AOB细菌紧密接近的生态位。在SZBAF中Candidatus_Nitrotoga包括有4种菌种, 优势菌种是Candidatus_Nitrotoga_uncultured_bacterium (上层和下层段序列数分别为116、121) , 此外还发现存在Candidatus_Nitrotoga arctica、Candidatus_Nitrotoga_uncultured_beta_proteobacterium、Candidatus_Nitrotoga_sp._enrichment_culture_clone_HAM-1。而Candidatus_Nitrotoga arctica仅在上层存在, 有研究表明^[17], 该菌只生长在低温4~17℃, 需要亚硝酸盐最佳浓度是0.3mM, 大约比正常培养硝化螺旋菌属低一个数量级, 甚至比硝化螺旋杆菌低两个数量级。本试验发现的菌种是在1~5.5℃内驯化近2个月后的系统中获得的。

表1 各生物群落中亚硝化单胞菌属在种水平的分布

图2 各生物群落中硝化螺旋菌属在种水平的分布

亚硝酸盐氧化细菌中的硝化螺旋菌属 (Nitrospira) 在种水平受温度影响也较大 (见图2) 。在低温运行前系统上层沸石段群落中硝化螺旋菌有6种, 序列数为65, 下层悬浮填料段硝化螺旋菌也有5种, 序列数为34。而经长期低温驯化后, 在生物膜中共存多种低温菌种。低温沸石段硝化螺旋菌有9种, 序列数为461;悬浮填料段硝化螺旋菌有12种, 序列数为376。低温水环境中优势硝化螺旋菌种分别为Nitrospira_sp.、Nitrospira_uncultured_bacterium、Nitrospira_uncultured_soil_bacterium、Candidatus_Nitrospira_defluvii, 这几种细菌在常温和低温下均存在, 但在低温水环境中数量得到明显增加, 说明这些细菌在低温条件下竞争力更强。另从表1、图2还可发现, 上层沸石段的硝化功能菌数量高于下层悬浮填料段, 硝化细菌在生物膜系统中生态位突出, 从而使系统上下层填料的硝化功能菌生物量都较丰富, 改善了单层曝气生物滤池生物量多集中于进水端的问题, 实现了生化系统和物化系统的耦合, 达到高效、稳定去除氨氮的目的。

经低温驯化后硝化细菌菌种种类和数量的增加与宏观上系统在低温期对氨氮较强的硝化作用是相符的。如图3所示, 对低温驯化期系统每日氨氮去除率进行统计学分析可见, 整个低温期, 5~5.5℃去除率分散性略大, 因系统刚进入低温期生物膜系统并未适应低温环境, 但此阶段沸石吸附作用较强。4~4.5℃对氨氮的去除率最稳定, 最大值和最小值距离较小, 中位数离最大值最近, 上四分位数和下四分位数分别是87.24和90.02, 差别较小。3~3.5℃系统对氨氮的去除率较低, 因外在原因导致生物量流失, 影响分散性, 此阶段不做详细分析。在1~1.5℃系统对氨氮的去除率分散性较集中, 且上四分位数和下四分位数也集中在数据的上部, 距最小值较远, 说明此阶段受损的生物膜系统获得恢复, 硝化作用增强, 硝化功能菌数量增加。

图3 低温期系统对氨氮去除的箱形

3 结论

(1) SZBAF系统中主要的氨氧化细菌是亚硝化单胞菌属 (Nitrosomonas) , 菌种的差异受温度影响较大。在低温条件下上层沸石段亚硝化单胞菌有14种, 序列数为100;下层悬浮填料段亚硝化单胞菌有16种, 序列数为68, 两者的优势菌种分别是Nitrosomonas_oligotropha、Nitrosomonas_sp._Is79A3和Nitrosomonas_uncultured_ammonia-oxidizing_bacterium, 其中优势最大的菌种是Nitrosomonas_uncultured_ammonia-oxidizing_bacterium, 该菌种在低温水环境下生态位更具优势。

(2) 在低温水环境下, SZBAF系统中亚硝酸盐氧化细菌菌属主要为Nitrospiraceae_Nitrospira和Candidatus_Nitrotoga。Candidatus_Nitrotoga是新型亚硝酸盐氧化细菌, 能功能性地代替硝化螺旋细菌 (Nitrospira) , 适宜在低温环境下成长, Candidatus_Nitrotoga_uncultured_bacterium是系统中优势菌种。

(3) 经低温驯化后SZBAF系统中Nitrospiraceae_Nitrospira种类较多, 优势硝化螺旋菌种分别为Nitrospira_uncultured_bacterium、Nitrospira_uncultured_soil_bacterium、Candidatus_Nitrospira_defluvii和Nitrospira_sp., 这几种细菌在常温和低温均存在, 但经低温驯化后菌种数量明显增加。

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Identification of nitrifying bacteria in biological aerated filter in pretreatment of polluted raw water at low temperature

Han Mei Gao Wei Cui Fuyi

(Technology Institute of Beijing Waterworks Group Co., Ltd., Beijing Engineering Research Center for Drinking Water Quality School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology The Administration Center of Urban-Rural Planning, Ministry of Housing and Urban-Rural Development Urban Water Administration Office, Ministry of Housing and Urban-Rural Development)

Abstract: The biological treatment process is the main way to solve the problem of ammonia nitrogen pollution in water sources, but the functional bacteria are affected by many factors in the system, especially by low temperature.Therefore, the identification of nitrifying bacteria suitable for low temperature water environment would help to build the optimal conditions, and then improve the process' ability to remove ammonia nitrogen.Based on a previously constructed suspended media-zeolite biological aerated filter, the nitrifying bacteria species acclimated to low temperature water environment and their succession were studied, after long-term acclimation under low temperature.The results showed that the major ammonia-oxidizing bacteria was Nitrosomonas, and the dominant species was Nitrosomonas uncultured ammonia-oxidizing bacterium.The major nitrite oxidizing bacteria were Nitrospiraand Candidatus Nrotrotoga.Nitrospirais a common nitrite oxidizing bacteria in engineered systems, while Candidatus Nrotrotogais a new species which can functionally replace Nitrospiraand is more adaptive to low temperature environment.Further classification of the nitrifying bacteria revealed that the dominant nitrite oxidizing bacteria species were Nitrospira uncultured bacterium, Nitrospira uncultured soil bacterium, Nitrospira sp., Candidatus Nitrospira defluvii and Candidatus Nitrotoga uncultured bacterium.

Keywords: Ammonia-oxidizing bacteria; Nitrite oxidizing bacteria; Biological aerated filter; Low temperature; Ammonia;

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