蓝藻水华是由水体富营养化引起的藻类爆发性增长的现象, 作为严重的水体环境问题, 近年来受到人们越来越多地关注^[1]。水华的形成会使水体产生异味、影响水质等问题, 甚至会引发动物和人类的疾病^[2]。水华发生后, 某些种类如微囊藻在受到外界环境胁迫时, 会刺激藻毒素的产生, 其死亡后, 细胞破裂也会释放大量的藻毒素。藻毒素是一种肝毒素, 在环境中可以长期稳定存在, 通过食物链进入人体后, 会引发肝炎甚至导致死亡^[3]。利用植物产生的化感物质 (对蓝藻具有抑制作用的植物或者微生物产生的次生代谢产物) 抑制藻类的生长是近年来发展的新技术, 为寻找高效安全的抑藻方法提供了新思路^[4~6]。化感抑藻具有生态安全、环境亲和、选择性高等特点^[7]。

　　 在以往的研究中已经分离出一些化感物质, 并且已经证明了它们的抑藻活性^[8], 目前发现的化感物质主要有游离蒽醌类^[9];萜类和甾类化合物^[10]、简单酚、苯甲酸及其衍生物^[11]、肉桂酸及其衍生物^[12]等, 它们的作用机理包括:影响细胞的光合作用^[13]、破坏藻细胞的结构^[14]、影响细胞正常生长所需酶的活性^[15]、干扰细胞DNA的损伤修复^[16]、妨碍藻细胞营养物质的吸收^[17]等, 从而抑制蓝藻生长和繁殖。

　　 但是, 化感技术仍处于探索阶段, 如何找到抑藻效果更好、环境影响更小、化感物质浓度更高的原料已成为限制这项技术的关键。中药是我国独特的资源, 蕴含着丰富的化感物质, 同时中草药具有普适性、低毒性的特点, 从中草药提取特定成分, 能为化感抑藻研究和化感制剂提供新的来源^[18]。本研究对比了4种中草药植物的抑藻效果, 从中筛选出有效的化感植物作为研究对象, 研究其植物浸提液的抑藻效果, 进而研究其抑制机理, 为开发新型化感制剂提供基础和参考。

　　 铜绿微囊藻:编号FACHB-905, 购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。铜绿微囊藻选用培养基BG11, 将铜绿微囊藻种接入到无菌的培养基中, 静置培养。培养温度为25±0.5℃, 通气培养, 光照强度为2 400lx, 光暗比为12∶12, 摇动3~4次/d, 经过多次扩大培养 (每次培养3星期) 后调整生长周期为对数期, 计数, 待用。

　　 化感植物:本试验所用的植物为大黄、虎杖、何首乌和决明子4种中药植物, 均购买于天津市中药材市场。

　　 主要仪器:人工气候培养箱 (PQX-250型) 、紫外可见光光度计 (UV-2700) 、高速冷冻离心机 (TGL16 M) 、岛津快速液相色谱仪 (DGU-20A) 等。

　　 称取200g中草药研磨成粉末, 其植物粗提取物的提取参照戴立洲等^[19]的方法。进一步, 将大黄有机粗提取物进行萃取得到2个分离组分, 分别为正己烷相和乙酸乙酯相, 通过旋转蒸发除去溶剂, 得到浸膏, 用二甲基亚砜 (DMSO) 定容, 得到提取母液, 进行抑藻试验。

　　 将1mL植物粗提物分别加入到100mL铜绿微囊藻培养液 (藻液初始浓度约为10⁷ cells/mL) 中 (对照组加入相同体积的DMSO溶液) , 且每组设置3个平行样。记录藻液的初始密度和OD (optical density) , 每48h测定一次。将5mL大黄有机提取物加入到500mL铜绿微囊藻培养液 (藻液初始浓度约为10⁶~10⁷ cells/mL) 中 (对照组加入相同体积的DMSO溶液) , 且每组设置3个平行样。记录藻液的初始密度和OD, 每48h测定一次, 叶绿素a、类胡萝卜素、藻胆蛋白和藻毒素每96h测定一次。叶绿素和藻胆蛋白的测定参照戴立洲等^[19]的方法;藻毒素的测定参照王爱杰^[20]的方法。

　　 铜绿微囊藻生长抑制率 (IR) 参照白羽等^[21]的计算方法, 如式 (1) 所示:

　　 式中E_n———第n天试验组的藻密度, cells/mL;

　　 C_n———第n天对照组的藻密度, cells/mL。

　　 将大黄、虎杖、何首乌和决明子提取液加入到培养的铜绿微囊藻 (藻液初始浓度约为10⁷ cells/mL) 中, 采用OD反映藻液浓度, 结果如图1所示。

　　 由图1可知, 空白、大黄、虎杖、何首乌和决明子的初始OD分别为:0.867、0.879、0.875、0.880和0.887, 经过14d的监测, 发现4种中药植物粗提物均有抑藻效果, 其中, 加入决明子提取液后, 在最初6d, OD呈现上升趋势, 在第8d之后增长速度下降, 在第14 d时, OD为1.18, 蓝藻抑制率为5.44%;加入何首乌提取液的藻液的OD变化趋势同决明子组相似, 在第14d时, OD为1.11, 蓝藻抑制率为11.1%;加入虎杖提取液的藻液在第14d时, OD为0.973, 蓝藻抑制率为22.2%;加入大黄提取液的铜绿微囊藻抑制效果明显, OD在第2d就呈现下降的趋势, 在第14d时, OD为0.5, 抑制率达到了60.0%。

　　 综上所述, 4种中草药植物对铜绿微囊藻均有抑制作用, 且抑制效果依次为:大黄>虎杖>何首乌>决明子。因此, 试验选择大黄作为化感植物进行萃取分相, 进一步研究大黄提取物的抑藻效果。

　　 将大黄提取物萃取为正己烷相和乙酸乙酯相。通过铜绿微囊藻培养液中的叶绿素a、类胡萝卜素、藻胆蛋白、藻毒素及藻细胞结构的变化研究2种萃取相的抑藻效果及其抑制机理。

　　 大黄提取物对铜绿微囊藻OD的影响如图2所示。

　　 由图2可知, 各组培养液初始OD约为0.688, 与空白对照组相比, 正己烷相和乙酸乙酯相均有抑藻效果, 其中, 加入正己烷相藻液的OD变化趋势与对照组相似, 在第16 d时, 正己烷相的OD为0.975, 抑制率较低为5.93%;乙酸乙酯相的OD与对照组相比, 其OD呈下降趋势, 在第16d时, OD为0.332, 抑制率达到了68.0%。分析原因是:大黄乙酸乙酯相中含有较多的化感抑制成分, 而正己烷中不含化感物质或者含量很少。

　　 在光合作用中, 绝大部分叶绿素的作用是吸收及传递光能, 仅极少数叶绿素a分子起转换光能的作用。它们在活体细胞中大多是与蛋白质结合在一起, 存在于类囊体膜上^[22]。类胡萝卜素能将吸收的光能传递给叶绿素a, 是光合作用不可缺少的光合色素。大黄提取物对叶绿素a和类胡萝卜素的影响分别如图3和图4所示。

　　 由图3可知, 各组初始叶绿素a约为1.56mg/L, 与空白对照组相比, 正己烷相和乙酸乙酯相对藻细胞中叶绿素a的表达均产生了抑制效果, 其中, 加入正己烷相的藻液中叶绿素a增长率明显低于对照组, 在第16d时, 叶绿素a的浓度为2.24mg/L, 抑制率为18.4%;加入乙酸乙酯相的藻液中叶绿素a与对照组相比, 呈现降低的趋势, 在第16d时, 叶绿素a的浓度为0.876mg/L, 抑制率为68.1%, 这与试验中藻液变黄及OD的变化情况相符。

　　 由图4可知, 各组藻液中类胡萝卜素初始值约为0.595mg/L, 与空白对照组相比, 正己烷相和乙酸乙酯相对藻细胞中的类胡萝卜素的表达也产生了一定的抑制效果, 其中, 加入正己烷相的藻液中类胡萝卜素虽呈上升趋势, 但是增长率明显低于对照组, 在第16d时, 类胡萝卜素的浓度为0.680mg/L, 抑制率为3.91%;加入乙酸乙酯相的藻液中类胡萝卜素与对照组相比, 出现了先增加后减小的趋势, 在第16d时, 类胡萝卜素的浓度为0.433mg/L, 抑制率为38.8%。

　　 铜绿微囊藻的藻胆蛋白包括藻蓝蛋白 (PC) 、别藻蛋白 (APC) 和藻红蛋白 (PE) , 能将吸收的能量传递给藻细胞叶绿素a, 即光合系统Ⅱ (PSⅡ) , 且这3种藻胆蛋白是蓝藻光合作用的主要功能团^[23]。藻胆蛋白的减少, 导致铜绿微囊藻吸收的能量传递给叶绿素a时受阻, 从而导致光合作用捕光能力下降, 进而抑制了藻类的光合作用^[24]。大黄提取物对藻蓝蛋白、别藻蛋白和藻红蛋白的影响分别如图5、图6和图7所示。

　　 由图5可知, 各组藻蓝蛋白初始值约为0.006 9mg/L, 与空白对照组相比, 正己烷相和乙酸乙酯相对铜绿微囊藻的藻蓝蛋白的表达均产生了抑制效果, 其中, 经正己烷相处理的铜绿微囊藻的藻蓝蛋白与对照组相比, 增加趋势缓慢, 在第16d时, 藻蓝蛋白的浓度为0.014 8mg/L, 抑制率为18.8%;由乙酸乙酯相处理的铜绿微囊藻的藻蓝蛋白呈现降低的趋势, 在第16d时, 藻蓝蛋白的浓度为0.000 8mg/L, 抑制率为95.3%, 抑制效果明显。

　　 由图6可知, 各组别藻蛋白初始值约为0.004 12mg/L, 与空白对照组相比, 正己烷相和乙酸乙酯相对铜绿微囊藻的别藻蛋白的表达均产生了抑制效果, 其中, 经正己烷相处理的铜绿微囊藻的别藻蛋白与对照组相比, 增加趋势缓慢, 在第16d时, 别藻蛋白的浓度为0.007 11mg/L, 抑制率为18.1%;由乙酸乙酯相处理的铜绿微囊藻的别藻蛋白呈现了先增加后减小的趋势, 在第8d时达到最高, 随后呈现出下降的趋势, 在第16d时, 别藻蛋白的浓度为0.002 20mg/L, 抑制率为74.6%。

　　 由图7可知, 各组藻红蛋白的初始值约为0.025 7mg/L, 与空白对照组相比, 正己烷相和乙酸乙酯相对铜绿微囊藻的藻红蛋白表达均产生了抑制效果, 其中, 由正己烷相处理的铜绿微囊藻的藻红蛋白与对照组相比, 增加趋势缓慢, 在第16d时, 藻红蛋白的浓度为0.036 3mg/L, 抑制率为4.45%;由乙酸乙酯相处理的铜绿微囊藻的藻红蛋白呈现先减小后增加的趋势, 在第8d时达到最高, 随后呈现出下降的趋势, 在第16d时, 藻红蛋白的浓度为0.021 9mg/L, 抑制率为42.4%。

　　 大黄提取物对铜绿微囊藻藻毒素的影响如图8所示。

　　 由图8可知, 各组藻毒素的初始值约为0.427mg/L, 与空白对照组相比, 正己烷相和乙酸乙酯相对铜绿微囊藻的藻毒素释放均产生了抑制效果, 其中, 加入正己烷相的铜绿微囊藻的藻毒素出现先增长后减少的趋势, 但是增长率明显低于对照组, 在第16d时, 藻毒素的浓度为0.332mg/L, 抑制率为51.2%;加入乙酸乙酯相后, 在第2d时, 藻毒素的含量至检测限以下, 抑制率约为100%。藻毒素的减少, 从侧面反映了液体中藻细胞含量的减少, 进而证明了乙酸乙酯相可以有效抑制藻细胞的生长。

　　 本研究分别对正己烷、乙酸乙酯处理8d后的藻细胞进行扫描电镜观察, 研究抑制过程中藻细胞外部形态特征的变化。

　　 由图9可知, 正常藻细胞表面光滑, 颗粒分布均匀, 细胞接近球形, 细胞直径为3μm左右, 个体分明, 细胞分裂比较旺盛, 周围有一些絮状的胞外分泌物 (图9a) 。正己烷相处理组的铜绿微囊藻部分出现了空洞, 有些藻细胞原生质体破裂, 藻细胞表面和周围分布絮状物 (图9b) 。乙酸乙酯相处理组的铜绿微囊藻表面光滑, 细胞形态不完整, 有细胞内溶物溶出, 细胞膜表面空洞, 藻细胞凹陷明显 (图9c) 。这可能是由于抑藻成分破坏了细胞膜的完整性, 使细胞的内溶物溢出所致^[25]。申琼等^[26]指出, 化感物质会引起膜结构的破坏和功能的丧失, 进而破坏叶绿素与酶结构, 从而影响藻细胞光合作用及酶活性, 最终导致细胞死亡, 这与本试验结果相符。

　　 (1) 试验选用大黄、虎杖、何首乌和决明子, 进行化感物质抑藻的研究, 结果表明:决明子、何首乌、虎杖和大黄的粗提取物对蓝藻生长的均有抑制效果, 抑藻率分别为5.44%、11.1%、22.2%和60%, 大黄粗提取物对铜绿微囊藻的生长抑制效果明显。

　　 (2) 大黄有机提取物对铜绿微囊藻的生长均有抑制作用, 经16d试验表明:正己烷相的抑制率为5.93%, 乙酸乙酯相的抑制率为68.0%, 乙酸乙酯相对铜绿微囊藻的抑制效果明显, 表明乙酸乙酯相中含有大量有效的化感物质。进一步试验表明, 乙酸乙酯相对叶绿素a的抑制率为68.1%, 对类胡萝卜素的抑制率为38.8%。乙酸乙酯相对蓝藻的藻胆蛋白各项指标抑制作用明显, 对藻蓝蛋白、别藻蛋白和藻红蛋白的抑制率分别为95.3%、74.6%和42.4%, 大黄有机提取物为铜绿微囊藻的抑制剂提供了新的供体。

　　 (3) 大黄乙酸乙酯相对藻毒素抑制效果明显, 在第4d时降至检测限以下, 对藻毒素的抑制率约为100%, 大黄乙酸乙酯相可有效抑制藻毒素的产生, 为寻找藻毒素的抑制剂提供了新的来源。

　　 (4) 本研究中已经表明, 大黄提取物对蓝藻的生长具有明显的抑制作用。在未来的研究中, 将继续进一步研究大黄提取物中具体化合物的抑藻作用及机理。目前本文对大黄提取物的研究主要聚焦于实验室内的探索, 后续会将具体的化合物进行实际工程的应用, 避免在抑制藻类生长的同时对水体造成二次污染。