甾体性激素是重要的微污染物^[1], 这类物质能在ng/L或更低浓度下产生内分泌干扰效应^[2]。环境中的雌激素和孕激素来源广泛, 除了人和动物自然代谢产生以外, 还被人工生产用于避孕药、激素替代药物、美容化妆品及人工饲料中^[3], 因此这类物质可以通过人为或自然途径进入到环境中^[4], 导致在环境中被广泛检出。

　　 环境中经常出现的性激素包括雌激素和孕激素, 激素类药物有雌酮、雌二醇、雌三醇和乙炔雌二醇以及孕激素左炔诺孕酮、醋酸环丙孕酮和孕二烯酮。水生生物中性反转个体、雌雄间体的出现, 交配方式的改变以及性腺生成障碍的发生都与雌激素和孕激素的污染有关^[5,6]。环境中的雌激素和孕激素也可能通过饮用水和食物链对人类健康造成潜在危害, 外源雌激素和孕激素能形成错误信号干扰生殖过程, 可能造成胎儿畸形或者影响第二性征的形成^[5], 可能对致病基因造成影响, 并与乳腺癌^[6]、子宫内膜异位^[7]、心脏病、骨质酥松症以及老年痴呆症^[8]的形成有关。

　　 松花江2009年前为哈尔滨的主要水源。但目前哈尔滨的主要水源磨盘山水库难以满足哈尔滨市不断增长的用水需求。根据规划2020至2030年, 哈尔滨市将实现各区统一联合供水, 供水水源主要将还是以松花江为主, 辅以磨盘山水库、西泉眼水库和地下水。这意味着在未来哈尔滨市的城市多水源供水格局中, 松花江将重担重任。为此有必要对松花江水质作全面了解, 特别是那些未列入检测项目, 而关于性激素物质在松花江的分布情况是几乎空白。本文选择使用广泛、活性较强的、雌二醇、雌三醇和乙炔雌二醇以及孕激素左炔诺孕酮、醋酸环丙孕酮和孕二烯酮为目标污染物, 研究它们在松花江哈尔滨段的时空分布及其潜在的毒理效应。

　　 目标物雌酮 (Estrone, E1, CAS 53-16-7) , 雌二醇 (17β-estradiol Estrone, E2, CAS 50-28-2) , 雌三醇 (Estriol, E3, CAS 50-27-1) , 乙炔雌二醇 (17α-ethynylestradiol, EE2, CAS 57-63-6) , 左炔诺孕酮 (Levonorgestrel, LNG, CAS 797-63-7) , 醋酸环丙孕酮 (Cyproterone acetate, CPA, CAS 427-51-0) , 孕二烯酮 (Gestodene, GES, CAS 60282-87-3) , 均购自日本TCI, 纯度大于97%, 内标物同位素标记双酚A (Bisphenol A-d₁₆) 购买于美国Sigma公司。试验中所用的主要有机溶剂甲醇、乙腈、丙酮、甲酸、正己烷均为HPLC级 (J.T.Baker公司) 。试验用水为超纯水 (>18.3MΩ, Milli-Q) 。

　　 目标污染物检测用在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱 (online SPE-UPLC-MS/M, Waters2777C-ACQUITY UPLC-XevoTM TQ MS S) 。MS为ESI源。雌激素类物质用负离子模式检测, 毛细管电压为3.5kV, 锥孔电压为60V;孕激素类物质用正离子模式检测, 毛细管电压为3.3kV, 锥孔电压为35 V。脱溶剂气温度为400℃, 流量为900L/h。目标物的质谱测定参数见表1。

　　 所用在线固相萃取柱为Oasis HLB Direct Connect HP (2.1mm×30mm, 20μm) 。超高压液相色谱用乙腈 (A) 和超纯水 (B, 含0.2%甲酸) 为流动相, 0~3.8 min, 为色谱柱制备进样阶段, 流速0.4 mL/min, A5%, B95%;3.8~4.1minUPLC流动相处理短暂停滞状态 (设置流速0.01mL/min) , 此段为onlineSPE洗脱为色谱柱上样阶段, 4.1min之后为样品在色谱柱分离阶段, 4.1~7 min, 流速0.4 mL/min, A5%, B95%;7~9 min, 流速0.4 mL/min, A95%, B5%;9.5~11.0min, 此阶段为平衡色谱柱, 为下次进样做准备, 流速0.4 mL/min, A5%, B95%。

　　 还对水样的常规指标进行检测, 例如温度、pH、UV₂₅₄、色度、浊度、溶解性有机碳含量 (DOC) 、总氮含量 (TN) 等。

　　 所有水样均用4L棕色玻璃瓶采集, 并使用具有聚四氟乙烯垫的瓶盖。取样瓶与瓶盖先用去离子水洗净, 然后用酒精预洗烘干, 密封备用。采样时先用水样润洗取样瓶及瓶盖3次, 再进行样品采集。在采样现场记录采样点的经纬度和高程, 并测定样品的温度和pH。在水样运回实验室的当天进行其他常规指标的测定。剩余水样避光、密封存于冰箱, 储存温度为4℃, 并在一周内完成对雌激素和孕激素的分析。在哈尔滨人口比较多的区域沿松花江设置10个采样点 (见图1) 。

　　 试验过程的QA/QC控制方法包括:采样现场空白 (Field Blank) 、方法空白 (Method Blank) 、加标空白 (Spiking Blank) 、基质加标平行和样品平行。所有的空白和样品都进行相同的处理。以10ng/L和20ng/L浓度目标物加标回收试验表明, 回收率为70%~101%。方法的检测限为0.1~1.0ng/L, 其中E1为0.2ng/L, E2为0.5ng/L, E3为0.8ng/L, EE2为1.0ng/L, CPA为0.3ng/L, LNG为0.1ng/L, GES为0.6ng/L。

　　 雌激素E1、E2、E3和EE2的浓度范围分别为ND~25.5ng/L、ND~9ng/L、ND~19.5ng/L和ND~8.7ng/L (见表2) 。孕激素CPA、LNG的浓度范围分别为ND~12.7ng/L和ND~3.4ng/L, GES在所有水样中均未检出。总体上, 雌激素的检出频率和检出浓度都比孕激素高, 而在4种雌激素中, 天然雌激素E1、E2和E3的检出频率和检出浓度都比合成雌激素EE2高。

　　 雌激素中检出频率最高的是E1和E2, 在30个水样中共有23次检出, 而且E1的检出浓度同时也是所有雌激素中最高的, 说明目标江段内E1的污染比较严重。此外, E3共在19个水样中被检出, 也具有较高的检出频率和检出浓度。孕激素中检出频率最高的是LNG, 在30个水样中共有25次检出, 但是LNG的检出浓度并不高, 均低于3.4ng/L。相比之下, CPA的检出频率虽然略低, 但检出浓度比较高, 所以污染更为严重。GES为新型的人工合成孕激素, 在所有水样中均未检出 (ND) , 说明该物质可能尚未在哈尔滨广泛生产和使用。与文献比较哈尔滨松花江中雌激素浓度水平在所收集的数据中处于中等位置, 与意大利、天津北塘河、嘉陵江的浓度水平相近^[9~11], 低于英国、美国、深圳河和云南滇池的浓度水平^[12,13]。孕激素CPA在目标江段的检出浓度低于西班牙的检出浓度, LNG的检出浓度与法国接近^[14], 低于马来西亚^[15]。总体上看, 松花江哈尔滨段的雌激素和孕激素污染水平处于中等污染水平。

　　 雌激素和孕激素的污染水平呈现江南高于江北的趋势 (见图1) , 这可能是由于哈尔滨市的人口主要集中在江南地区, 生活污水和工业废水的排放也主要集中在江南地区, 而排入松花江的水中可能含有未完全去除的雌激素和孕激素类物质, 因此江南地区的雌激素和孕激素类物质的污染水平也更高。同时, 在目标江段的下游地区, 雌激素和孕激素的检出种类和检出浓度也有所增加, 这可能与排入江中的污废水的种类和数量在下游地区有所增加有关。在人类活动比较频繁的地区, 如采样点6, 雌激素和孕激素的污染水平也比较高。采样点3是原二水源的附近, 虽然该点位于所选江段的上游, 但由于附近鱼类养殖业比较发达, 人类休闲活动比较集中, 可能带来污染, 所以该点的雌激素和孕激素污染水平高于下游一些地区。采样点4和采样点5分别位于何家沟的上游和下游, 采样点9和采样点10分别位于马家沟的上游和下游。在图1中可以看到, 采样点5和采样点10的雌激素和孕激素污染水平高于采样点4和采样点9, 可以推测何家沟和马家沟的汇入在一定程度上加剧了松花江的污染。

　　 雌激素和孕激素的污染水平除了随采样点的不同而变化外, 也因采样时期的不同而存在较大差异 (见图2) 。冰雪消融期的雌激素和孕激素总浓度最大, 该时期各采样点雌激素和孕激素总浓度的平均值达到35.3ng/L, 而枯水期的雌激素和孕激素总浓度最小, 各采样点雌激素和孕激素总浓度的平均值仅为7.0ng/L。冰雪消融期的雌激素和孕激素污染水平较高可能是因为在这个时期, 除了有较大负荷的城镇生活和工业点源之外, 还有一定负荷的面源污染物伴随着融化的雪水汇入河流, 同时, 水的流动速度加快可能会使原本吸附在底泥中的雌激素和孕激素重新溶入水中, 所以尽管冰雪融化对江水中的污染物具有一定的稀释作用, 但雌激素和孕激素的总浓度还是有较大升高。丰水期各采样点雌激素和孕激素总浓度的平均值为26.2ng/L, 可能是因为五月份雨水充沛, 雨水的冲刷也会把部分面源污染物带入江中, 使得丰水期的雌激素和孕激素污染水平也比较高。

　　 在枯水期, 各雌激素和孕激素的检出浓度比较低, 检出的目标污染物主要是雌激素E1、E2与孕激素CPA、LNG。这几种物质所占比例之和超过90% (见图3a) 。同时, 因采样点的不同, 雌激素和孕激素的组成有较大变化, 在采样点1、3、6、7、9, 雌激素所占比例较大, 而在其余采样点, 孕激素所占比例较大。总体上, 两类物质的浓度相当。但冰雪消融期与丰水期的雌激素和孕激素组成较枯水期有较大变化。

　　 在这两个时期, 雌激素的检出浓度增大了很多, 而孕激素的检出浓度较枯水期没有显著差别, 所以雌激素在目标污染物中所占比例大大增加。E1、E2和E3之和在冰雪消融期至少占雌激素和孕激素总和的50%, 在丰水期至少占雌激素和孕激素总和的60%。在冰雪消融期与丰水期, 雌激素与孕激素的比例因地点不同而变化的幅度较小, 但几种雌激素之间的浓度比例有一定的波动, 这可能是在某些条件下雌激素间相互转化的结果。研究表明, 人类平均每人每天排出的E1与E2的含量之比约为4.17^[16]。Johnson等^[17]预测污水处理厂进水中E1与E2含量之比约为2.30, 并发现这一比值符合污水处理厂中测得的实际值。可见人类释放到环境中的E1和E2的含量符合一定的比例关系, 因此, 研究实际水体中E1与E2的比值能够帮助分析水中这两种物质的来源。

　　 E1/E2值在0~7.37之间波动, 其平均值为2.21 (见图4) , 与污水处理厂进水中的E1/E2值接近。但落入人类贡献预测范围的采样点并不多, 只有6个, 占总数的20%。大部分采样点的E1/E2值在5左右, 考虑到部分E2在生物降解过程中会生成E1^[18], 推测E1/E2值偏高可能是由于生活污水经过了污水处理厂的处理造成的, 也可能是由于部分E2在环境中被微生物降解为E1造成的, 因此不排除这些采样点的雌激素和孕激素的存在也受人类影响的可能。枯水期大部分采样点的E1/E2值为零, 因为在这些水样中均未检出E1或E2。冰雪消融期的6号和8号采样点, 以及枯水期的1号和5号采样点的E1/E2偏离人类贡献预测值的范围比较远, 有可能是其他污染造成的, 也可能受环境中其他因素的影响。

　　 松花江哈尔滨段中雌激素总浓度最高可达43.8ng/L, 孕激素总浓度最高可达12.7ng/L, 说明松花江哈尔滨江段已在一定程度上受到了雌激素和孕激素类物质的污染。为了分析松花江哈尔滨段的水体中存在的雌激素和孕激素对生态系统造成危害的可能性, 采用文献中商值法表征目标江段内各雌激素和孕激素的生态风险。用预测无影响浓度 (Predicted No Effect Concentration, PNEC) 表征污染物的危害程度, 将污染物实测环境浓度 (Measured Environmental Concentration, MEC) 与PNEC进行比较, 计算其风险商值 (Risk Quotient, RQ) , 见式 (1) 。

　　 RQ值越大, 表明污染物的存在对环境的生态风险就越大。若RQ<1, 可认为该污染物的存在暂无生态风险, 但可能需要进行进一步的监测;若RQ>1, 则表明该污染物存在生态风险。松花江哈尔滨段中各采样点中各雌、孕激素中RQ值大于1的频率最高的是LNG (n=25) , 其次是E1 (n=23) 、E2 (n=23) 和E3 (n=17) , 说明这几种物质的存在对松花江哈尔滨段的生态系统有较大程度的潜在危害。特别地, LNG这种物质在各个时期和各个采样点的RQ值都比较大, 平均RQ值达到133。其中最大RQ值为425, 出现在冰雪消融期的6号采样点, 说明需要采取相关措施加以控制。虽然EE2只有两次被检出, 但因其PNEC值极低 (0.002ng/L) , 这两次的RQ值都很大, 表明这种物质虽然在目标河段中浓度很低, 存在时间很短, 但其对生物具有很高的活性, 因此仍然值得关注。CPA的RQ值均远远小于1, 说明该物质的存在应该暂时不会对生态系统造成影响。GES作为一种新型的人工合成孕激素, 未在目标河段中检出, 暂时也不会对生态系统造成危害。

　　 各雌激素的活性可以以雌二醇当量因子 (Estradiol Equivalence Factor;EEF) 表示, 由EEF和实测环境浓度 (MEC) 可计算各雌激素的雌二醇当量 (Estradiol Equivalence Quantity, EEQ) , 见式 (2) 。

　　 EEF的取值参考隋倩等^[19]的研究成果, 均采用生物体外毒性试验所测得的EEF的最大值进行计算。计算所得的各采样点的EEQ值如表3所示。

　　 由于混合雌激素对生物的作用强于单一雌激素的累加^[20], 故英国环境署于2002年提出, 以1ng/L作为EEQ的预测无影响浓度^[21]。由表3可见, 除了枯水期有若干采样点的EEQ值小于1ng/L之外, 各采样点在各时期的EEQ值均大于1ng/L, 说明松花江哈尔滨江段内雌激素的存在可能会对水中的生物造成不利影响。枯水期、冰雪消融期和丰水期的EEQ平均值分别为2.8ng/L、29.2ng/L和11.9ng/L。其中EEQ的最大值出现在冰雪消融期的采样点9, 浓度高达92.52ng/L, 已远远高于EEQ的预测无影响浓度, 需要采取相关措施加以控制。

　　 (1) 松花江哈尔滨段在一定程度上受到了雌激素和孕激素类物质的污染。雌激素E1、E2、E3和EE2的浓度范围分别为ND~25.5ng/L、ND~9ng/L、ND~19.5ng/L和ND~8.7ng/L, 孕激素CPA、LNG的浓度范围分别为ND~12.7ng/L、ND~3.4ng/L, 孕激素GES在所有水样中未检出。

　　 (2) 这类物质的在江水中的分布受到取样时间和取样地点的影响。冰雪消融期和丰水期的污染水平较高, 雌激素和孕激素总浓度的平均值分别为35.3ng/L和26.2ng/L, 枯水期污染水平较低, 雌激素和孕激素总浓度的平均值为7.0ng/L。人类活动密集地区和河沟汇入口下游地区的污染水平有所增加。通过分析雌激素和孕激素的时空分布规律以及E1与E2的浓度比的范围, 发现人类活动为这类物质污染的主要因素。

　　 (3) 生态风险评价结果表明, 松花江哈尔滨段的水体中存在的E1、E2、E3和LNG的风险商值较大, 可能存在生态风险。雌激素活性分析结果也表明, 水体中的EEQ浓度大于预测无影响浓度, 需要采取相关措施加以控制。