蓝藻水华已成为全球性的环境问题,蓝藻水华导致水质性缺水和水体功能下降。在我国大部分富营养化水体中蓝藻水华主要以铜绿微囊藻为优势藻种^[1] ,对当地生态环境和社会经济造成巨大的损失,并制约当地经济的发展^[2] ,因此,有效防治蓝藻水华的暴发是当前迫切需要解决的问题。

　　 目前蓝藻水华控制方法主要采用物理、化学和生物方法,如向水体直接投加化学杀藻剂(硫酸铜和絮凝沉降等),仍缺乏高效、安全和低成本的蓝藻控制方法^[3] 。植物化感抑藻是一种新型有效的控制藻类水华的方法^[4] ,植物化感抑藻具有绿色、低成本、化感物质容易获得、热稳定性高和无二次污染等优点^[5] ,在应用上具有很好的发展前景。已对陆生植物^[6] 、浮水植物^[7] 、挺水植物^[8] 和沉水植物^[9] 等大量高等植物分泌物或浸泡液化感抑藻性质开展研究;并对植物化感抑藻物质及结构的分析^[10,11] 和化感抑藻作用机理^[12,13] 等开展大量研究。

　　 前人化感物质抑藻试验主要采用某一初始藻密度接种到化感物培养基中进行研究^[14,15,16] ;张维昊等^[17] 采用两厢培养池方法,在BG11培养液^[18] 中开展菖蒲培养液对4组不同初始吸光度铜绿微囊藻化感抑藻试验;陈卫民等^[19] 采用苦草与铜绿微囊藻混合培养的方法,在BG11培养液中进行不同初始藻密度培养试验。以上试验均在非限制营养盐条件中进行,而培养基中营养盐对化感抑藻具有重要作用^[20] ,未对不同初始接种藻密度作对照试验,不能解释化感作用对不同初始密度的影响。因此,本研究采用鄱阳湖洲滩灰化苔草浸泡液,在富营养水平中开展不同初始接种藻密度化感抑藻试验,以期揭示化感物质对不同初始接种藻密度生长的影响,为植物化感抑藻选择恰当时机提供科学数据。

　　 蓝藻门铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)购自中国科学院水生生物研究所。在500mL锥形瓶中加入200mL无菌培养基BG11^[18] ,放置在光照培养箱中,保持温度在(29±0.1)℃,光照强度2 500lx,光照周期为24∶0(h),每天摇动3次,将处于对数生长期的藻种备用。

　　 初春在鄱阳湖南矶山湿地保护区采集灰化苔草及土壤,土壤厚度(200±20)mm,(150±20)mm的正方形样方10块带回试验室进行培养试验,去除样方中的其他杂草及枯落物等,仅保留新鲜灰化苔草,统计各个样方所含灰化苔草的植株数(135±4)株,植株高度(350±12)mm,无显著性差异(p>0.05)。将样方置于塑料圆桶中(上下直径800mm,610mm,高800mm),桶底部铺垫(60±5)mm砂,再将植物样方置于沙层上进行培养,将所有单元培养装置放置在露天培养,每天添加自来水补充蒸发水分,用HH2型土壤水分仪(Moisture Meter)测定土壤水分含量。从2014年4月10~25日在室外培养15天后灰化苔草发出新芽和新的根系,已适应室内培养条件,开始不同水位的淹没试验。每组做2组平行。

　　 试验使用自来水作为淹没介质,淹没根部组水深(30±5)mm(L),淹没中部组水深(200±5)mm(M),全淹没组水深(350±5)mm(H),蒸发水使用自来水补充;从2014年4月25日~5月29日连续淹没35天后,全淹没组灰化苔草枯黄死亡,淹没底部组和半淹组灰化苔草生长良好。浸泡液过0.45μm滤膜,人工培养基采用BG11作为对照组(C),调节培养基中总氮和总磷浓度分别为2mg/L和0.2mg/L,备用。将配置好的培养液使用30 W紫外灯灭菌120min后备用,以实现无菌培养。

　　 在光照培养箱中使用锥形瓶批式培养开展试验,在250mL锥形瓶中添加150mL备用浸泡液,控制温度(29±0.2)℃,光照强度2 500lx,光暗比24h∶0(h),初始藻密度分别5×10⁴、10×10⁴、20×10⁴和80×10⁴(个/mL),每天人工摇动3次,再随机放置。培养装置使用30 W紫外灯杀菌2~4h,再进行培养试验;试验过程中采用严格无菌操作,每组设置3个平行样。

　　 藻细胞计数采用血球板计数法,隔天上午8:30从摇匀后的培养基中吸取1 mL藻液至试管中,吸取0.1mL到血球计数板上在双面光学显微镜下计数,3次计数取平均值。

　　 浸泡液对铜绿微囊藻的抑制率计算公式为:

　　 式中IR———抑制率;

　　 N₀———对照组中藻密度;

　　 N———试验组中藻密度。

　　 根据隔日测得的生物量,按以下公式计算藻比增长率(μ)^[21] :

　　 式中x_n———当天的细胞数值,个/mL;

　　 x_n-1———前一天的细胞数值,个/mL;

　　 t_n———对应于x_n的培养天数,d;

　　 t_n-1———对应于x_n-1的培养天数,d。

　　 为便于对比分析,以初始藻密度5×10⁴个/mL为基准,将初始接种密度为10×10⁴、20×10⁴和80×10⁴(个/mL)分别除以系数2、4和16,计算得到的藻细胞密度作图,如图1所示。从图1中可以看出,对照组中各初始接种藻密度铜绿微囊藻密度均高于试验组中铜绿微囊藻密度。对比不同淹没高度,不同初始接种藻密度在接种初期,藻密度差异较小,随培养时间的增加铜绿微囊藻生长差异增加,表明灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻化感作用与化感作用时间有关;在各试验组中铜绿微囊藻细胞密度随接种密度的增加呈先增加后降低的趋势,初始接种密度5×10⁴个/mL和80×10⁴个/mL中生物量增加最低;在底部和中部淹没组中,初始接种藻密度为10×10⁴个/mL中生物量增量最大,在全淹试验组中初始接种藻密度为20×10⁴个/mL组中增加量最大;各试验组中全淹条件下得到的灰化苔草浸泡液对不同初始藻密度生长抑制作用更高。

　　 计算不同初始接种藻密度在灰化苔草浸泡液中铜绿微囊藻的抑制率,以最大抑制率制图,如图2所示。从图2可以看出,不同初始接种藻密度在L、M和H组中均受灰化苔草浸泡液化感抑制,随淹没高度增加而增加,在全淹没试验组中铜绿微囊藻的抑制率最高;在各淹没组中,灰化苔草浸泡液中铜绿微囊藻抑制率,随微囊藻初始接种密度的增加而降低;初始接种藻密度5×10⁴个/mL在H组中抑制率最高为88.8%,在L组、M组中抑制率分别为68.7%和77.6%;在淹没根部组中初始接种密度为80×10⁴个/mL时抑制率最低为50.6%,在M组和H组中抑制率分别为62.1%和72.0%。可见在微囊藻生长初期进行植物化感抑藻具有更好的抑制效果。

　　 计算不同初始接种藻密度在灰化苔草浸泡液中铜绿微囊藻的比增长率μ,然后求出比增长率最大值(μ_max),将所得最大比增长速率作图,如图3所示。从图3可以看出,在人工培养基中微囊藻最大比增长速率差异较小,为0.68~0.72d^-1;初始接种藻密度为5×10⁴个/mL和10×10⁴个/mL的各试验组中微囊藻最大比增长速率均高于对照组微囊藻最大比增长速率,初始接种藻密度为20×10⁴个/mL和80×10⁴个/mL的各试验组中微囊藻最大比增长速率均低于对照组中微囊藻最大比增长速率。在试验组中微囊藻最大比增长速率在初始接种藻密度为10×10⁴个/mL时最高,为0.72~0.78d^-1;微囊藻最大比增长速率随初始接种藻密度的增加呈先增加后降低的变化趋势;同一初始接种藻密度中,微囊藻最大比增长速率随灰化苔草淹没高度的增加而降低,全淹组为0.51~0.55d^-1。

　　 不同初始接种藻密度微囊藻最大现存量见图4。从图4可以看出,在对照组中微囊藻现存量均高于各试验组;在对照组和各试验组中微囊藻最大现存量随初始接种藻密度的增加而增加,在初始接种密度为80×10⁴个/mL组中最大;各初始接种藻密度下,各试验组中微囊藻最大现存量随淹没高度的增加而降低,其中全淹组中最低。

　　 通过试验分析发现,鄱阳湖灰化苔草浸泡液对不同初始接种密度铜绿微囊藻均产生化感抑制作用,抑藻率随初始密度的增加而降低。其他研究发现陆生植物、浮水植物、挺水植物和沉水植物等^[6,7,8,9] 分泌物或浸泡液均具有化感抑藻作用,植物化感抑藻主要通过破坏细胞结构,改变藻类光合作用、呼吸和酶活性等^[22,23] 抑制藻类生长。

　　 本试验在富营养化培养基中进行化感抑藻研究,在3种灰化苔草浸泡液促进较低初始接种藻密度试验组中铜绿微囊藻的最大比增长速率,初始接种藻密度较高试验组中微囊藻最大比增长速率受化感物质的抑制和营养盐限制而降低;初始接种密度最低和最高组中微囊藻增加量最低,3种淹没高度得到培养液,均在初始密度为5×10⁴个/mL试验组中微囊藻抑制率最高,在68.7%~88.8%;张维昊等^[17] 在营养盐非限制条件下进行菖蒲化感抑藻试验,得到初始接种藻密度较低时铜绿微囊藻的生长受到抑制,当初始接种藻密度吸光度OD680为0.3时微囊藻吸光度有所提高,在吸光度OD680为0.2时抑制率最高;陈卫民等^[19] 在营养盐非限制条件下开展枯草与铜绿微囊藻的化感抑藻试验,得到在混合培养条件下初始藻密度低于7×10⁶个/mL时微囊藻生长降低,在分开培养中初始藻密度为14×10⁶个/mL时微囊藻生长降低。

　　 当初始接种藻密度较低时,试验组中微囊藻密度低于对照组中微囊藻密度(p<0.05),培养基为微囊藻生长提供足够营养盐,铜绿微囊藻主要受浸泡液中化感物质的抑制作用;初始接种藻密度较高时,培养基中营养盐被耗尽,培养液中化感物质抑藻能力增强,从而抑制铜绿微囊藻的生长,Fistarol等^[24] 和Skovgaard等^[25] 得到培养基中营养盐缺乏条件下产生的化感物质抑制作用较非磷限制条件下的抑制作用更强;Johansson等^[26] 研究发现小三毛金藻(Prymnesium parvum)过滤液化感活性在贫营养盐条件下化感活性更高;Lippemeier等^[27] 研究指出在营养盐限制条件下化感物质将降低藻细胞PSⅡ光子效率,这与野外观察发现结果相似。通过本研究发现在富营养化水体中利用植物化感抑藻,为选择适宜的藻密度达到化感抑藻提供科学依据。

　　 (1)试验结果表明,在富营养化培养基中,不同初始接种藻密度影响灰化苔草浸泡液对铜绿微囊藻的抑制作用;在初始接种密度为5×10⁴个/mL试验组中铜绿微囊藻的抑制率最高,在微囊藻生长初期化感抑制效果更显著。

　　 (2)初始接种密度小于10×10⁴个/mL时灰化苔草浸泡液提高铜绿微囊藻最大比增长速率,初始接种密度大于20×10⁴个/mL时灰化苔草抑制铜绿微囊藻最大比增长速率;初始接种密度为5×10⁴个/mL和80×10⁴个/mL组中微囊藻增量最低,初始接种密度最低组中最大生物量也最低。

　　 (3)产生这一现象的原因,主要是受培养基中化感物质和营养盐共同作用,在初始藻密度较低时微囊藻生长主要受灰化苔草浸泡液中化感物质的抑制作用,随初始藻密度的增加化感物质对铜绿微囊藻的抑制能力降低,培养液中营养盐降低至耗尽限制微囊藻的生长。