水厂蜡样芽孢杆菌的灭活工艺研究
0 引言
芽孢杆菌属微生物直径为4~10μm, 属于革兰氏阳性菌, 包含多粘芽孢杆菌、枯草杆菌 (包括蜡样杆菌和地衣芽孢杆菌) 、短芽孢杆菌和致病的炭疽芽孢杆菌等, 不利条件下生成具有强耐氯能力的芽孢, 广泛存在于水源水中[1]。而芽孢杆菌及芽孢会导致人发生感染性食物中毒[2]。
根据《生活饮用水卫生标准》 (GB 5749-2006) 中对细菌总数的要求以及原水中芽孢杆菌及其芽孢难于灭活的特性, 关于饮用水中芽孢杆菌及其芽孢的消毒, 已开展了部分研究。耿淑洁等[3]采用臭氧-氯联合灭活饮用水中枯草芽孢杆菌芽孢进行的研究结果表明, 枯草芽孢杆菌芽孢对氯消毒具有很强的抵抗力, 而臭氧对枯草芽孢杆菌芽孢有较好的灭活效果, 臭氧-氯联用消毒对枯草芽孢杆菌芽孢的灭活效果大大增强。刘枫等[4]使用臭氧对枯草芽孢杆菌及芽孢的灭活研究表明, 芽孢杆菌和芽孢的灭活效果受臭氧浓度和作用时间的共同影响。张永吉等[5]研究了氯和紫外线灭活枯草芽孢杆菌的协同作用, 结果表明氯消毒时, 对枯草芽孢杆菌的灭活效果很低, 紫外线消毒对枯草芽孢杆菌有较好的灭活效果, 当紫外线与氯联合使用时, 随着紫外线剂量及氯投量的增加, 二者的协同作用增强;此外, Zhang等[6]研究了UV和H2O2联合应用对枯草杆菌芽孢的灭活作用, 发现在100μW/cm2紫外辐射, 0.5mM H2O2剂量氧化10 min条件下, 芽孢灭活效果为5.88对数级。灭活效果随着UV剂量的增加而提高。赵建超等[7]研究了紫外-氯联合灭活地下水水源的真菌灭活效果, 发现高紫外剂量-低加氯量可以达到低紫外剂量-高加氯量的灭活效果, 同时减少了消毒副产物的生成量。
新发展起来的陶瓷膜超滤物理截留技术, 广泛应用于微生物过滤过程, 可以有效地截留水厂出水中的芽孢杆菌及其芽孢。现有的研究表明:在一定的条件下, 陶瓷膜过滤对芽孢的去除率达到了95%以上[8~11]。
本研究以深圳某水厂出厂水中检测到的优势菌种蜡样芽孢杆菌作为研究对象, 研究了多种氧化剂和陶瓷膜对蜡样芽孢杆菌及其芽孢的灭活和去除效果, 以期探索水厂出水中芽孢杆菌异常时的应急处理及综合处理工艺。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选取蜡样芽孢杆菌作为研究对象, 分离自长流陂水厂滋生芽孢杆菌时的水厂出水中。芽孢杆菌的培养选用营养肉汤培养基, 培养基灭菌冷却后将蜡样芽孢杆菌菌种接种至培养基中于37℃培养箱中震荡培养约18h, 而后经过离心 (3 500g, 10min) 在用无菌PBS (pH=7.2) 的缓冲液清洗2次获取蜡样芽孢杆菌储备液, 置于4℃冰箱中备用。采用孔雀绿染色法染色确认其中菌体是否处于细菌状态, 若其中芽孢比例较高可适当减少培养时间。
将营养肉汤中的蜡样芽孢杆菌1 mL接种于50mL产芽孢培养基[酵母抽提物 (yeast extract) 0.7g/L, 葡萄糖1g/L, 蛋白胨1g/L, 七水硫酸镁0.2g/L, 硫酸铵0.2g/L]中, 于37℃震荡培养48h。通过离心后用无菌磷酸缓冲溶液再悬浮收集、离心, 弃去上清液, 反复离心3次, 将沉淀物重新悬浮于一定量的无菌PBS中, 然后巴氏灭菌 (80℃, 20min) 以去除细胞繁殖体, 并于4℃冰箱保存备用。
1.2 采用平板计数法测定芽孢浓度
以营养琼脂为培养基, 37℃恒温培养24h后计菌落数。为保证试验结果的准确性, 每个水样在有效检测范围内 (30~300个/mL) 取2个有效稀释倍数, 每个稀释倍数取2个平行样计数。
1.3 蜡样芽孢杆菌芽孢的氧化剂灭活及物理截留
研究不同氧化剂 (NaClO、H2O2、臭氧、单过硫酸氢钾复合盐) 、高级氧化工艺对于芽孢杆菌芽孢的灭活效果。配制一定高浓度的上述氧化剂储备液, 根据设定浓度添加到40 mL含芽孢的反应体系中采用NaHSO3在特定时间淬灭反应以研究不同氧化剂灭活芽孢随时间的关系。高级氧化采用紫外 (UV-C) 与H2O2结合的方式考察不同紫外线强度对于灭活芽孢效果的影响。
利用陶瓷膜处理含芽孢原水, 小试中采用的超滤膜为日本某平板陶瓷膜, 陶瓷膜表面是亲水性的, 其支撑体和涂层均为Al2O3, 平均孔径为60~70nm, 尺寸为80 mm×70 mm×6 mm, 膜面积为112cm2, 陶瓷膜片为两面对称结构, 运行时两面同时进水。
2 结果与讨论
2.1 NaClO对于芽孢的灭活效果
目前, 氯消毒技术广泛应用于全国不同城市水厂, 图1是使用10 mg/L和20 mg/L的NaClO处理25 500CFU/mL芽孢后的灭活情况。可以看出氯在5~10 min时对芽孢的灭活效率最高;在25 500CFU/mL的初始芽孢浓度下, 20 mg/L的NaClO对芽孢的灭活效率高于10mg/L时的NaClO;10 min后, 芽孢浓度分别为5 000 CFU/mL和12 000 CFU/mL。NaClO浓度为20 mg/L时, 60min后芽孢浓度降为0CFU/mL;NaClO浓度为10mg/L时, 芽孢浓度降低至1 000CFU/mL, 直到120min时芽孢浓度降为0。可见, 氯消毒能够有效灭活芽孢, 氯浓度越大灭活效率越高。
2.2 H2O2对于芽孢的灭活效果
图2为5mg/L、10mg/L、20mg/L的H2O2处理芽孢后的灭活情况。随着H2O2浓度的提高, 对芽孢灭活效率明显升高。H2O2浓度为20mg/L和10mg/L时, 在0.5~1 min内芽孢灭活速度最快, 分别降低了67 000CFU/mL和33 000CFU/mL;H2O2浓度为5mg/L时, 在1~2 min内灭活速度最快。到30min时, 3种H2O2浓度下最终芽孢浓度基本相同, 均在6 000~7 000CFU/mL。虽然H2O2能在一定程度灭活芽孢, 但不能完全去除芽孢。
2.3 臭氧对于芽孢的灭活效果
使用1 mg/L、2mg/L和5 mg/L的臭氧处理芽孢后的灭活情况如图3所示。臭氧的浓度越大, 芽孢的灭活效率越高, 且最终灭活效率均达到稳定。臭氧作用速度十分迅速, 试验的3种臭氧浓度下芽孢浓度均在1 min左右即达到稳定。1 mg/L、2mg/L和5mg/L的臭氧浓度下, 芽孢的最终稳定浓度分别为30 000CFU/mL、20 000CFU/mL和0CFU/mL。相比于NaClO对芽孢的灭活时间, 臭氧对芽孢的灭活时间明显更加快速。
2.4 单过硫酸氢钾复合盐对于芽孢的灭活效果
图4为10mg/L和20mg/L的单过硫酸氢钾复合盐处理芽孢后的灭活情况。在单过硫酸氢钾浓度为20mg/L时, 芽孢浓度随接触时间增加逐渐降低, 到第5min时芽孢浓度即由45 000CFU/mL降到0CFU/mL。而在10 mg/L的单过硫酸氢钾浓度下, 尽管芽孢的浓度随反应时间的增加也在降低, 但是在第10 min时, 芽孢浓度由95 000CFU/mL降到5 000CFU/mL后便保持稳定。单过硫酸氢钾复合盐水溶液浓度越高, 腐蚀性越强, 在碱性条件下稳定性下降。
2.5 紫外线 (UV) 和H2O2联用对芽孢的灭活效果
由于单独使用H2O2不能完全灭活芽孢, 因此采用紫外线辐照与10mg/L的H2O2联用强化芽孢灭活效果。结果如图5所示, 在紫外线辐照辅助下, H2O2对芽孢的灭活效果明显增强, 30μW/cm2的紫外线强度下, 第20min芽孢浓度降低为0CFU/mL。当紫外线辐照强度增加到60μW/cm2和120μW/cm2的紫外线强度时, 第10min时芽孢浓度就降低为0CFU/mL。这表明, 紫外线 (UV) 和H2O2联用时相比于单独的H2O2氧化灭活效果, 其对芽孢的灭活效果更加显著。
2.6 陶瓷膜超滤对芽孢的处理效果
图6为使用陶瓷膜处理芽孢的效果。当芽孢浓度66 000CFU/mL左右时, 膜出水芽孢浓度直接降为0CFU/mL, 且在试验30min内保持稳定。因为芽孢的尺寸 (5~10μm) 远大于陶瓷膜的孔径 (60~70nm) , 所以陶瓷膜能够完全截留芽孢。
2.7 氧化剂与陶瓷膜过滤联用对芽孢的处理效果
在原水中除了芽孢, 还存在着大量的其他细菌、藻类等有机污染物, 直接使用陶瓷膜处理原水时容易造成滤膜堵塞, 降低膜的使用寿命。Khadre等[12]研究, 氧化剂可以通过·OH破坏芽孢的细胞壁及细胞膜, 从而降解细胞。如果首先利用氧化剂对原水中的细菌及芽孢进行预氧化处理, 使细胞灭活降解, 就可以延长超滤膜的使用寿命。
因此接着对氧化剂联用陶瓷膜超滤技术进行了研究。采用投加氧化剂与陶瓷膜超滤的组合工艺来处理含芽孢原水, 其效果分别如图7、图8所示。图7为陶瓷膜处理含芽孢原水时投加10 mg/L的NaClO氧化剂, 投加氧化剂后, 原水中芽孢浓度随着反应时间的增加逐渐降低, 30min内从65 000CFU/mL降低到21 000CFU/mL, 陶瓷膜出水的芽孢浓度基本稳定在0。图8为陶瓷膜处理含芽孢原水时投加10mg/L的H2O2氧化剂, 投加氧化剂后, 原水中芽孢浓度随着反应时间的增加逐渐降低, 30min内从22 000CFU/mL降低到6 000CFU/ml, 膜出水的芽孢浓度同样基本稳定在0。在工艺生产中, NaClO和H2O2能有效灭活原水中大部分细菌及芽孢, 使细胞破坏降解, 从而降低陶瓷膜使用负荷。
2.8 水厂中芽孢杆菌芽孢的应急控制技术建议
水厂的出厂饮用水关系人们的日常生活和身体健康, 因此出厂水必须满足《生活饮用水卫生标准》 (GB 5749-2006) 中对细菌总数的要求。传统的工艺 (混凝、沉淀、过滤、消毒) , 能灭活或者截留大部分芽孢杆菌和芽孢, 但在饮用水的生产过程中, 偶尔会检测出芽孢杆菌属细菌及其芽孢。在此情况下, 需要构建1套快捷有效的芽孢杆菌及其芽孢的应急控制技术。
结合以上试验结果, 在使用水厂常规工艺NaClO时, 10mg/L的NaClO在120min时能够完全灭活芽孢, 作用时较长。而相比于NaClO灭活效果:20mg/L H2O2虽然能在短时间灭活芽孢, 但是却不能完全去除芽孢;20mg/L单过硫酸氢钾复合盐在5min时也能够完全去除芽孢, 不过其在碱性条件下稳定性不高;5 mg/L O3可以在1 min内完全去除芽孢杆菌及芽孢, 对芽孢的灭活效率最好。故建议水厂应急处理芽孢杆菌及芽孢渗漏时, 首先使用O3对原水进行预氧化, 再经常规工艺混凝、沉淀、过滤、消毒, 从而达到完全去除芽孢杆菌及芽孢的效果。
3 结论
(1) 氧化剂对芽孢的灭活效果。NaClO、O3以及单过硫酸氢钾复合盐均能使原水中芽孢浓度降为0。其中臭氧对芽孢的灭活速度最快, 效率最高。
(2) 高级氧化技术对芽孢的灭活效果。UV+H2O2联用时, H2O2对芽孢的灭活效率明显增强。当紫外线辐照强度为60μW/cm2时, 10min内芽孢浓度就降低为0。
(3) 氧化剂联合陶瓷膜超滤技术优势。陶瓷膜工艺属于物理截留作用, 单独使用陶瓷膜时, 水厂出水芽孢浓度基本为0 (图6) , 但同时也截留了水中其他杂质及菌体, 增大了陶瓷膜的使用负荷。
NaClO和H2O2对原水进行预氧化可以氧化降解大部分细菌及芽孢, 降低陶瓷膜的负荷并延长其使用寿命。
[2] 周逞力, 向丽琼, 向微.洪江市一起蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒调查.实用预防医学, 2014, 21 (8) :965~967
[3] 耿淑洁, 胡学香, 胡春.臭氧-氯联合灭活饮用水中枯草芽孢杆菌芽孢的研究.环境工程学报, 2011, 5 (3) :489~493
[4] 刘枫, 陈忠林, 昌盛.臭氧灭活水中枯草芽孢杆菌的效果.黑龙江大学自然科学学报, 2015, 32 (2) :229~235
[5] 张永吉, 刘文君, 张琳.氯对紫外线灭活枯草芽孢杆菌的协同作用.环境科学, 2006, 27 (2) :329~332
[6] Zhang Y, Zhang Y, Zhou L, et al.Factors affecting UV/H2O2inactivation of Bacillus atrophaeus spores in drinking water.J Photochem Photobiol B, 2014, 134 (94) :9~15
[7] 赵建超, 黄廷林, 文刚, 等.紫外-氯顺序灭活地下水源水中真菌的效能.环境工程学报, 2016, 10 (12) :6867~6872
[8] 张和禹, 王亚男, 魏国清, 等.陶瓷膜超滤技术应用于桑椹汁的澄清与除菌加工.蚕业科学, 2010, 36 (1) :148~151
[9] 刘飞云, 潘道东.鲜乳陶瓷膜除菌技术研究.食品科学, 2008, 29 (3) :256~259
[10] 张锡辉, 范小江, 韦德权, 等.臭氧-平板陶瓷膜新型净水工艺中试研究.给水排水, 2014, 40 (1) :120~124
[11] 范小江, 雷颖, 韦德权, 等.臭氧-陶瓷膜集成工艺的饮用水安全性研究.中国给水排水, 2014, 30 (15) :44~49
[12] Khadre M A, Yousef A E.Sporicidal action of ozone andhydrogen peroxide:a comparative study.Int.J.Food Microbiol, 2001, (71) :131~138