臭氧-生物活性炭工艺作为饮用水和污水深度处理技术, 在国内外已广泛用于工程实践。生物活性炭技术是去除水中污染物的有效技术^[1,2]。生物活性炭去除污染物的机理为:活性炭吸附作用和微生物作用^[3]。研究表明, 臭氧-生物活性炭工艺去除水中有机物是活性炭吸附和生物降解的协同作用, 并且随着生物活性炭使用时间延长生物作用越来越突出^[4]。目前, 国内外的研究主要集中在生物活性炭的生物活性^[5]以及微生物群落结构的研究^[6,7]。深度处理工艺中的活性炭颗粒是贫营养环境, 传统的培养分离方式只能培养鉴别出一小部分菌种。高通量测序技术的发展使得低浓度DNA样品的测序成为可能, 但将这一方法应用在生物活性炭生物膜微生物群落解析的研究还很少^[8]。

本文采用Miseq高通量测序技术对活性炭床微生物群落结构进行全面解析, 评估金山水厂炭池微生物群落结构, 以期揭示臭氧-生物活性炭工艺去除有机物的机理。

臭氧接触池的臭氧投加量为1.0~2.0 mg/L, 接触时间10min;生物活性炭池流速10m/h, 炭层厚度为2m, 空床接触时间为12~14min, 反冲洗采用先气冲后水冲洗方式。

将金山水厂的炭池一次性放空, 分别采集8个炭池的表层炭样 (0~20cm) , 编号分别为1-1, 2-1, 3-1, 4-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1;以及6号炭池和8号炭池的40~60cm、100~120cm处炭样, 分别编号为6-2, 6-3, 8-2, 8-3。将采集后的炭样固体离心倒出上清液后放入-20℃冰箱保存。

利用Fast DNA^TMSpin Kit for Soil试剂盒提取微生物基因组总DNA。

前引物为338F, 序列ACTCCTACGGGAG-GCAGCAG;后引物为806R, 序列为GGACTACH-VGGGTWTCTAAT。

PCR扩增条件:为了保证后续数据分析的准确性及可靠性, 需要两个条件, 首先是尽可能使用低循环数扩增;其次保证每个样品扩增的循环数统一。为了达到以上目的, 首先随机选取10个样品进行预试验, 以确保在最低的循环数中绝大多数的样品能够扩增出浓度合适的产物, 为所有样品的正式试验做充分准备。

在预试验完成后, PCR正式试验采用Trans Gen AP221-02:Trans Start Fastpfu DNA Polymerase, 20μL反应体系:4μL 5×Fast Pfu Buffer, 2μL 2.5 m Md NTPs, 0.8μL Forward Primer (5μM) , 0.8μL Reverse Primer (5μM) , 0.4μL Fast Pfu Polymerase, 10ng Template DNA。

PCR反应参数:a.1× (3 min 95℃) ;b.27× (30s95℃;30s55℃;45s72℃) ;c.10 min 72℃, 10℃until halted by user按指定测序区域, 合成带有barcode的特异引物。

PCR扩增的产物由上海美吉生物医药科技有限公司测序。上机测序采用Illumine公司的Miseq测序仪进行测序分析。

炭池不同深度的生物量分布结果显示炭池的微生物主要分布在炭池的表层^[9], 因此, 本次全面评估了金山水厂8个炭池的表层活性炭微生物;并且选取长期跟踪的6号和8号炭池, 分析炭池40~60cm、100~120cm的微生物群落。进行DNA测序的样品分别为:1~8号炭池表层 (0~20cm) 生物活性炭, 以及6号、8号炭池40~60cm、100~120cm的活性炭, 评估不同炭池、不同位置的微生物群落结构的特点。

表1为8个炭池表层样品测序信息。Shannon指数越大, 群落多样性越高。从表1可以看出, 8个样品的Shannon指数均趋向平坦, 说明测序数据量足够大, 能够反映样品中绝大多数的微生物物种信息。另外, 8个炭池除了3号炭池, 其余7个炭池表层活性炭的Shannon指数在1.5左右, 生物多样性趋于一致。3-1 (即3号炭池表层0~20cm) 的Shannon指数为2.93, 生物多样性高于其他炭池。

对全部序列进行系统分类学统计分析, 共检测出23种菌门, 分析8个样品中细菌的优势菌门 (菌群所占百分比大于1) 以及相对比例。图1为门水平上各炭池微生物群落组成分析柱状图。

从图1可以看出:1~8号炭池, 除了3号炭池, 其余7个炭池的优势菌门均为Firmicutes (厚壁菌门) 和Proteobacteria (放线菌门) , 其中Firmicutes (厚壁菌门) 占绝对优势, 所占比例均超过92%以上, Proteobacteria (放线菌门) 所占比例在7%左右。3号炭池与其他炭池存在差异, 除了最优菌门Firmicutes (厚壁菌门) 和第二优菌门Proteobacteria (放线菌门) 外, 还存在Acidobacteria (酸杆菌门) 、Chloroflexi (绿弯菌门) 、Bacteriodetes (拟杆菌门) , 以及Planctomycetes (浮霉菌门) 这4种优势菌群。因此, 从8个炭池的优势菌群的总体分布来看, 金山水厂活性炭池的优势菌门为两种, 即:Firmicutes (厚壁菌门) 和Proteobacteria (放线菌门) 。

进一步分析8个炭池, 各个样品中主要的微生物种属, 在8个活性炭样品中共检出12种优势种属 (占样品1%以上的种属) , 分析结果如表2。

从表2看出:Bacillus (芽孢杆菌属) 、Lactococcus (乳球菌属) 、Enterococcus (肠球菌属) 、Streptococcus (链球菌属) 、Carnobacterium (肉食杆菌属) 、Cronobacter (阪崎肠杆菌属) 均为8个炭池的优势菌属, 1号和2号炭池还存在Pseudomonas (假单胞菌属) , 3号炭池还存在Acidiferrobacter以及TRA3-20_norank、Nitrosomonadaceae_uncultured、TA18_norank3类未明确分类的优势菌属。从8个炭池的优势菌群的总体分布来看, 金山水厂活性炭池的优势菌属为:Bacillus (芽孢杆菌属) 、Lactococcus (乳球菌属) 、Enterococcus (肠球菌属) 、Streptococcus (链球菌属) 、Carnobacterium (肉食杆菌属) 、Cronobacter (阪崎肠杆菌属) 以及Pseudomonas (假单胞菌属) 。8个炭池中Bacillus (芽孢杆菌属) 占绝对优势, 所占比例均达到60%, Lactococcus (乳球菌属) 为第二优势菌群, 所占比例在20%以上。

Bacillus (芽孢杆菌属) 属于厚壁菌门, 是专性需氧菌或兼性厌氧菌, 为化能异养菌, 必须利用有机碳为碳源的细菌;Lactococcus (乳球菌属) 属于厚壁菌门, 兼性厌氧, 是化能异养菌;Enterococcus (肠球菌属) 属于厚壁菌门, 需氧及兼性厌氧菌, 化能异养, 发酵代谢;Streptococcus (链球菌属) 属于厚壁菌门, 多数兼性厌氧, 少数厌氧;Carnobacterium (肉食杆菌属) 属于厚壁菌门, 厌氧生长;Cronobacter (阪崎肠杆菌属) 属于变形菌门, 兼性厌氧;Pseudomonas (假单胞菌属) , 属于变形菌门, 专性需氧。以上可以看出活性炭中的优势菌属几乎都为专性需氧或者兼性厌氧菌, 这些细菌利用有机碳为碳源, 即利用水中有机污染物质作为碳源, 从而实现水中有机污染物质的去除。

图2为6号炭池门水平上不同深度微生物群落组成分布。6-1为6号炭柱活性炭表层0~20cm处, 最优势菌门为Firmicutes (厚壁菌门) , 所占百分比为96.28%, 其次是Proteobacteria (放线菌门) 3.23%;6-2为6号炭柱活性炭40~60cm处, 最优势菌门为Firmicutes (厚壁菌门) , 所占百分比为83.62%, 其次是Proteobacteria (放线菌门) 12.99%, Acidobacteria (酸杆菌门) 0.99%;6-3为6号炭柱活性炭100~120cm处, 最优势菌门为Firmicutes (厚壁菌门) , 所占百分比为94.13%, 其次是Proteobacteria (放线菌门) 4.45%。图3为8号炭池门水平上不同深度微生物群落组成分布。8-1为8号炭柱活性炭表层0~20cm处, 最优势菌门为Firmicutes (厚壁菌门) , 所占百分比为92.22%, 其次是Proteobacteria (放线菌门) 7.53%。8-2为8号炭柱活性炭40~60cm处, 最优势菌门为Firmicutes (厚壁菌门) , 所占百分比为96.49%, 其次是Proteobacteria (放线菌门) 为3.19%;8-3为8号炭柱活性炭100~120cm处, 最优势菌门为Firmicutes (厚壁菌门) , 所占百分比为91.96%, 其次是Proteobacteria (放线菌门) 6.50%。

6号和8号炭池不同深度上优势菌门的种类一致, 并且最优势菌门、第二优势菌门、第三优势菌门均相同, 只是在丰度上存在差异。从门水平上微生物分布情况来看, 不同深度的优势菌门相差不明显。

图4为6号炭池属水平上不同深度微生物群落组成分布。6-1为6号炭柱活性炭表层0~20cm处, 最优势菌属为Bacillus (芽孢杆菌属) , 所占比例为64.12%。第二优势菌属为Lactococcus (乳球菌属) 23.58%。其次是Enterococcus (肠球菌属) 2.57%, Streptococcus (链球菌属) 2.16%, Carnobacterium (肉食杆菌属) 1.45%, Cronobacter (阪崎肠杆菌属) 0.9%;6-2为6号炭柱活性炭40~60cm处, 最优势菌属为Bacillus (芽孢杆菌属) , 所占比例为56.98%。第二优势菌属为Lactococcus (乳球菌属) 19.43%。其次是Enterococcus (肠球菌属) 2.26%, Streptococcus (链球菌属) 2.01%, TA18_norank为1.55%, Carnobacterium (肉食杆菌属) 1.24%, Variibacter为1.16%;6-3为6号炭柱活性炭100~120cm处, 最优势菌属为Bacillus (芽孢杆菌属) , 所占比例为64.04%。第二优势菌属为Lactococcus (乳球菌属) 21.71%。其次是Enterococcus (肠球菌属) 2.68%, Streptococcus (链球菌属) 2.20%, Carnobacterium (肉食杆菌属) 1.67%。

图5为8号炭池属水平上不同深度微生物群落组成分布。8-1为8号炭柱活性炭表层0~20cm处, 最优势菌属为Bacillus (芽孢杆菌属) , 所占比例为61.38%。第二优势菌属为Lactococcus (乳球菌属) 21.86%, 其次是Enterococcus (肠球菌属) 2.66%, Streptococcus (链球菌属) 2.48%, Carnobacterium (肉食杆菌属) 1.67%, Cronobacter (阪崎肠杆菌属) 0.9%;8-2为八号炭柱活性炭40~60cm处, 最优势菌属为Bacillus (芽孢杆菌属) , 所占比例为66.81%。第二优势菌属为Lactococcus (乳球菌属) 20.88%, 其次是Enterococcus (肠球菌属) 2.73%, Streptococcus (链球菌属) 2.35%, Carnobacterium (肉食杆菌属) 1.62%, Cronobacter (阪崎肠杆菌属) 0.95%;8-3为8号炭柱活性炭100~120cm处, 最优势菌属为Bacillus (芽孢杆菌属) , 所占比例为61.48%。第二优势菌属为Lactococcus (乳球菌属) 21.79%, 其次是Enterococcus (肠球菌属) 2.12%, Streptococcus (链球菌属) 2.11%, Carnobacterium (肉食杆菌属) 1.55%, Cronobacter (阪崎肠杆菌属) 0.87%。

从属的水平上看, 炭池不同深度上优势菌属的种类基本上一致, 最优势菌属、第二、第三、第四优势菌属均相同, 只是在丰度上存在差异, 且差异不大。结合6号和8号炭柱不同深度微生物群落的分布, 可以看出, 相同炭柱, 不同位置微生物群落差异不明显。

(1) 从8个炭池表层共检测到23种菌门, 金山水厂活性炭池的优势菌门为两种:Firmicutes (厚壁菌门) 和Proteobacteria (放线菌门) 。

(2) 金山水厂活性炭池的优势菌属为:Bacillus (芽孢杆菌属) 、Lactococcus (乳球菌属) 、Enterococcus (肠球菌属) 、Streptococcus (链球菌属) 、Carnobacterium (肉食杆菌属) 、Cronobacter (阪崎肠杆菌属) 以及Pseudomonas (假单胞菌属) 。8个炭池中Bacillus (芽孢杆菌属) 均占绝对优势, 所占比例均达到60%, Lactococcus (乳球菌属) 为第二优势菌群, 所占比例在20%以上。

(3) 金山水厂炭池活性炭中的优势菌属均为专性需氧或者兼性厌氧, 这些细菌利用水中有机污染物质作为碳源, 从而实现水中有机污染物质的去除。

(4) 同一炭池不同深度, 优势菌门和优势菌属基本上相同, 微生物群落差异不明显。