N₂O作为重要的温室气体之一，在污水生物脱氮过程中的产生和排放一直备受关注。研究表明，N₂O主要在异养反硝化和氨氧化过程中产生^[1,2]。在异养反硝化中，硝态氮（NO₃^--N）可以还原为亚硝态氮（NO₂^--N），然后还原为NO、N₂O，最后还原为N₂。该过程中参与的酶包括NO₃^--N还原酶（Nar),NO₂^--N还原酶（Nir),NO还原酶（Nor）和N₂O还原酶（Nos)^[3]。目前，在生物脱氮过程中关于N₂O的研究很多。Pan和Lu等^[4,5]发现，在电子供体不足条件下，4种反硝化还原酶之间会存在电子竞争。由于Nos竞争力较弱，N₂O还原速度较慢，容易导致N₂O积累^[6,7,8]。而胞内聚合物作为电子供体时降解速度较慢，无法为反硝化提供足够的电子，这也容易导致N₂O积累^[3,9,10]。另外，Zhou等^[11]已经发现，当游离亚硝酸（free nitrous acid,FNA）为0.002mg/L时也会发生N₂O积累。

NO作为反硝化过程中N₂O的前体，与污水中生物脱氮密切相关。有研究表明NO可以与氨反应生成肼，并通过厌氧氨氧化途径生成N₂^[12]。在亚硝酸盐型厌氧甲烷氧化过程（n-DAMO）中，Methylomirabilis oxyfera(M.oxyfera）可以将NO分解为N₂和O₂^[13]。Castro-Barros等^[14]发现，亚硝酸盐的存在会促进NO的产生。此外，还有研究发现，在氨氧化过程中，NO的积累与DO和pH密切相关^[15,16]。然而，在众多研究中，关于异养反硝化过程中NO抑制的报道却很罕见。Schulthess等^[17]的研究表明，在亚硝酸盐反硝化过程中发生NO大量积累，并且严重抑制了反硝化过程中的各种还原酶的现象。但是，NO的抑制机理尚不清楚，还需进一步研究。

在本研究中，采用厌氧/缺氧（An/A）模式运行的序批式反应器（SBR），研究了亚硝酸盐反硝化过程中NO和N₂O的积累。本研究的目的是研究不同碳氮比条件下NO和N₂O的产生特征，并进一步阐明NO和N₂O的积累机理，可为解异养反硝化过程中NO和N₂O积累机理提供理论支撑。

SBR反应器高35cm，直径16cm，反应器容积6L，有效容积5L（见图1）。反应器利用鼓风式曝气，底部设置曝气沙盘，全程采用机械式搅拌混合，试验过程中温度控制在（30±1）℃。厌氧/好氧/缺氧（An/O/A）模式下装置每日运行3个周期，每个周期480min。每次进水5min，厌氧60min，好氧曝气120min，缺氧270min，静沉、排水25min。每周期进出水2L，由KG316T微电脑时控开关进行控制切换试验工况。批式试验过程将时控运行装置开关由自动控制模式转换为手动控制模式，厌氧搅拌60min后，投加亚硝酸钠溶液，直至反应结束。

试验接种污泥取自西安市长安区某污水处理厂卡鲁塞尔氧化沟反应池。启动初期，反应器中MLSS在2 800mg/L左右，逐步提高反应器进水氨氮浓度，控制厌氧段中期游离氨稳定在5mg/L左右。通过控制曝气量维持硝化阶段溶解氧在0.5～0.8mg/L，经过20d污泥驯化，短程硝化率达到99%以上，说明反应器驯化成功。反应器稳定运行阶段测得MLSS为6 042 mg/L,MLVSS为4 729mg/L。

在An/O/A模式运行稳定之后，定期（间隔1d）将该模式改变为An/A模式。研究4组COD/N对亚硝酸盐反硝化过程中N₂O和NO积累特征。

An/O/A运行模式进水为人工配置，其具体组分为：C₆H₁₂O₆0.21g/L,KH₂PO₄0.02g/L,MgSO₄·7H₂O 0.02g/L,CaCl₂0.006 4g/L,NaH-CO₃ 0.6 g/L,NH₄HCO₃ 0.271 g/L，微量元素0.04ml/L。

An/A试验进水为人工配制，不同COD/N(1、2.5、5、10）下COD初始浓度分别为40 mg/L、100mg/L、200 mg/L、400 mg/L,NaNO₂浓度为40mg/L，其余组分均与An/O/A运行模式进水组分相同。

An/A试验在An/O/A运行工况结束阶段进行，并且每个工况结束时停止进水，并进行3次以上洗泥（向反应器中注入30℃的水，并搅拌均匀5min后静沉、排水，如此重复3次）从而去除工况结束时未反应的含氮物质。N₂O探测仪在反应器中的测试示数与空白值相差小于1mV后开始试验，每组试验配水浓度按照上述所列组分进水，NaNO₂溶液在厌氧搅拌60min后投加。

初始段控制反应条件如温度、pH、DO等基本一致，厌氧段开始前需要测定反应器中NO、N₂O的背景值。试验过程中对反应系统各项水质指标以及溶解态的N₂O、NO进行了全程测量与记录。

试验中进出水NO₃^--N、NO₂^--N、COD及NH₃-N浓度测定均采用国际标准方法^[18],pH测定采用pH S10便携式智能酸度计（四川成都方舟科技有限公司），溶解氧（Dissolved Oxygen,DO）使用HachHQ30d溶氧仪（哈希，美国）进行监测。

溶解态N₂O、NO以丹麦Unisense微电极系统测得（每10s读取1个数据）。N₂O释放量通过清水搅拌下溶解态N₂O逸出曲线计算得到^[19]。

图2为不同COD/N条件下NO和N₂O积累特征曲线。4组COD/N下反硝化过程均有不同程度的N₂O积累。COD/N为2.5、5、10的3种情况均出现了NO积累量的快速增加，并且对反硝化过程产生了抑制。

在COD/N为1时，未发生NO积累及其对反硝化反应的抑制。其原因是在该低COD/N下，碳源不足，反硝化菌群对亚硝酸盐的反硝化速率缓慢，产生的少量NO被迅速还原为N₂O。

当COD/N为2.5时，在此条件下产生了NO的积累和抑制作用，NO积累浓度最大值达到4.3mg/L，抑制持续时间约15min。

图2c所示COD/N为5的变化曲线，其NO积累浓度最大达到4.5mg/L,NO抑制反硝化的作用抑制持续时间约40min，为4种COD/N中抑制程度最大的情况。

图2d所示为COD/N为10的变化曲线，NO积累浓度最大达到5.3mg/L,NO的抑制作用时间约15min。其抑制作用小于COD/N为5时，且在NO积累期间，仍然有亚硝酸盐的降解。

根据以上结果可知，在不同COD/N下NO积累的峰值分别为0.4 mg/L、2 mg/L、4.3mg/L和5.3mg/L。这说明NO积累峰值与COD/N密切相关。众所周知，在亚硝酸盐反硝化过程中，NO₂^--N首先转化为NO，然后转化为N₂O，最后转化为N₂。因此，NO₂^--N还原速率会影响NO的累积量。当COD/N增加时，NO₂^--N转化为NO的速率也会随之增加，这有可能会导致NO的累积量相对较高。

结果显示，在缺氧初始阶段NO迅速增加，这与传统的反硝化不同。在传统反硝化过程中，由于NO还原速率较高（高于NO₂^--N），因此一般情况下不会有NO累积。而在本试验中，NO的快速积累可能与厌氧阶段的电子积累量有关。Pan等^[20]发现在没有电子受体的情况下，微生物可以将有机物转化为还原态电子载体（Mred）。当系统中添加电子受体（例如NO₂^--N）时，Mred会迅速被氧化成氧化态电子载体（Mox)(NO₂^-+1/2Mred+H⁺→NO+1/2Mox+H₂O）。总电子载体浓度（Mtot）定义为Mred和Mox之和。可以推测在厌氧阶段，Mred的数目大约等于Mtot，即大多数电子载体都是还原态存在。积累的Mred使还原酶的周转率处于最佳状态。当在反应器中加入NO₂^--N时，由于Nir的高活性，积累的Mred可以立即与NO₂^--N反应，这导致缺氧阶段开始时NO迅速积累。而且Mred积累的越多，产生的NO越高。如前文所述，高浓度NO的积累会对反硝化过程中的还原酶（Nir,Nor和Nos）有危害。文献[21]显示，Nos对NO毒性最敏感，其次是Nor，最后是Nir。这3种还原酶对NO的50%抑制浓度分别为0.5 mg/L、0.3 mg/L和0.075mg/L，这明显低于缺氧阶段开始时的NO积累。因此，Nir、Nor和Nos很有可能会被NO抑制。但是由于NO抑制系数不同，所以抑制程度也有所不同。因此，不同的抑制导致NO产生速率高于还原速率。因此，在此阶段NO浓度迅速增加。

高浓度NO的积累会使得反硝化过程被抑制。如图2所示，不同的COD/N(2.5、5、10）下，NO抑制时间分别15min、40min和10min。结果表明，NO对反硝化的抑制作用不仅与NO浓度有关，还与COD浓度有关。

如图2b所示，在反硝化过程中观察到3个NO累积峰。当NO积累达到最大时，Nir和Nor可能会被完全抑制。此时，NO的降低一部分是逸出所致。同时，为了减轻NO的毒性，微生物会通过其他途径将NO转化为无害物质，从而使NO积累量减少。当NO降至较低水平时，反硝化所涉及的还原酶将逐渐恢复。文献[21]显示，Nos对NO毒性最敏感，其次是Nor，最后是Nir。因此，Nir活性比Nor更容易恢复，这会导致NO再次积累。之后，由于微生物的解毒和NO的逸出作用，NO再次降低。由图2b可以观察到第二次NO积累远低于第一次。这表明还原酶的活性已部分恢复。第三次NO的累积和还原与第二次相似。经过一段时间的适应后，还原酶的活性完全恢复，此时没有NO的积累，并维持在非常低的水平。

图2d显示，在COD/N为10时，NO积累与其他COD/N不同。在此条件下NO的下降分为2个阶段，即快速下降阶段和缓慢下降阶段。当NO含量较高时，Nir、Nor和Nos的活性可能会受到抑制。NO的快速下降可能与NO的逸出和微生物解毒有关。可以推测，在高COD/N下，微生物具有很强的抵抗NO毒性和快速恢复活性的能力。因此，当NO降低到一定水平时，Nir的活性得以恢复，但由于Nor没有完全恢复，这导致NO再次发生积累，并且在此阶段NO的下降速度减慢。但是，由于Nos对NO和FNA比较敏感，Nos无法立即恢复。因此，在此阶段，N₂O积累迅速增加。

文献报道，FNA对反硝化有抑制，其抑制阈值为0.002mg/L^[11,22]。在本研究中，当N₂O迅速下降时，FNA浓度为0.001 5～0.002 5 mg/L，接近Zhou等^[11]报道的FNA抑制阈值。据此推测，N₂O的积累可能是FNA抑制所致。缺氧初期，FNA对Nos有抑制，反硝化以N₂O为主要终产物。随着反应的进行，NO₂^--N浓度逐渐降低，pH逐渐升高，使得FNA浓度不断降低。当FNA浓度下降至较低水平时（Nos不受抑制），N₂O可被还原为N₂。

结果表明，FNA对Nos的抑制作用受COD/N的影响较大，这可能是双重抑制所致。Pan等^[5]发现，低COD/N会加剧反硝化还原酶之间的电子竞争，导致N₂O的大量积累。而强烈的电子竞争会加剧FNA的抑制，因此，在低COD/N下，FNA的抑制浓度较低。当COD/N为1时，FNA的抑制浓度为0.004 8 mg/L，高于其他COD/N。当COD/N为1时，没有足够的电子供体来还原N₂O,N₂O的还原主要是逸出，而不是生物还原。因此，在该条件下FNA抑制浓度较高，但这不是真正的抑制阈值。

由表1可知，随着COD/N的增加，N₂O的峰值逐渐增大。随着COD/N的增大，会有更多的电子来进行反硝化。与低COD/N相比，Nir和Nor可以获得的电子数增多。而提供的电子越多，NO₂^--N和NO的还原速度越快，导致N₂O的积累越高。此外，一些研究表明，N₂O的积累速率与N₂O的与还原速率有关^[22]。当Nos被抑制时，N₂O越快，NO₂^--N还原为N₂的速率越小，N₂O的积累量越大。因此，当初始NO₂^--N浓度相同，FNA高于Nos抑制阈值时，N₂O的积累峰值随COD/N的增大而增大。

此外，根据先前的研究和2.1节的讨论，NO抑制也是导致N₂O积累的另一个重要原因^[17]。NO是一种毒性物质，对反硝化过程中的还原酶有严重影响。Nos作为最敏感的还原酶，很容易被NO抑制，导致N₂O的积累。

如图2所示，N₂O还原过程中pH呈现出逐渐下降的趋势，这与传统理论（即以PHB为电子供体的N₂O还原过程中pH会升高）不同。可能的原因是：PHB作为电子供体和N₂O的积累导致了pH的降低。NO₂^--N的还原可以用式（1）～式（3）来描述，其中C₄H₆O₃代表3-酮丁酸的分子式。

这些方程证明了以PHB为电子供体还原N₂O时，pH降低，CO₂分子在反应器中会溶解，消耗碱度，导致pH下降。

本文研究了不同COD/N条件下NO和N₂O的积累特征，并对其产生机理进行分析，得出的主要结论如下：

(1）缺氧初期NO快速积累主要是由于缺氧期积累的电子快速反硝化所致。

(2）试验中检测到的NO积累量远高于以往的研究。高浓度NO会导致亚硝酸盐的反硝化被完全抑制。

(3)N₂O的积累主要与FNA抑制和COD/N有关。在相同的NO₂^--N浓度下，N₂O的积累量随COD/N的增大而增大。

(5）与传统反硝化过程中pH的升高不同，以胞内聚合物为电子供体的N₂O还原过程中pH降低。