随着我国城市化发展和生活水平的不断提升,市政供水水质达到高品质、优质饮用水,甚至可直饮的需求日益增加^[1]。管道直饮水是指原水经一定处理后通过管道直接供给人们饮用,其在西方国家中已有较多的应用^[2]。自20世纪90年代,我国第一个以楼宇为单位的直饮水工程在上海某小区运行以后,直饮水系统在其他城市也开始推行与应用^[3]。2018年6月,深圳市发布了“优质饮用水入户工程第二阶段实施方案”的通知(深府办函[2018]38号),计划用3年完成优质饮用水入户工程^[4]。同年,全国第一部生活饮用水水质地方标准《上海市生活饮用水水质标准》(DB 31/T 1091—2018)正式发布^[5]。这些水质相关方案和标准的出台,标志着市政供水的高品质饮用水也将在不久的未来在我国普及^[6]。

随着高品质、优质饮用水等自来水直饮的提出,饮用水的微生物安全保障凸显重要性。有研究者对2006～2013年北京部分学校管道直饮水中的微生物指标进行调查,结果表明有21.34%的样品受到微生物污染^[7]。我国市政供水执行的《生活饮用水标准》(GB 5749-2006)微生物细菌指标中,仅包括大肠菌群(大肠埃希氏菌、总大肠菌群、耐热大肠菌群)和细菌总数。《饮用天然矿泉水》(GB 8537-2008)标准中还包括粪链球菌,铜绿假单胞菌,产气荚膜梭菌。《包装饮用水》(GB 19298-2014)食品安全国家标准中也包括了铜绿假单胞菌。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),又称绿脓杆菌,属于假单胞菌属,变形杆菌门,是一种比较常见的条件致病菌,广泛存在于土壤、水、空气及动物肠道、皮肤等环境中,在潮湿的环境尤甚^[8,9]。在特定的情况下可引起呼吸系统、泌尿系统和胃肠道等多种急性和慢性感染以及败血症。研究表明^[10],饮用水中铜绿假单胞菌污染偶有发生,且后果往往较为严重。如饮用受铜绿假单胞菌污染的桶装饮用水会导致呕吐、腹泻的事件的发生^[11]。因此,饮用水中铜绿假单胞菌的监测与防控对于居民用水安全有着重要的意义。

多个国家都对饮用水中铜绿假单胞菌的数量进行限定,如美国、加拿大、欧洲、日本、巴西及世界卫生组织对饮用水中铜绿假单胞菌含量的限定为MPN(最大可能数)<3/L或每250 mL水样中不得检出^[12]。我国《饮用天然矿泉水》(GB 8537-2008)和《包装饮用水》(GB 19298-2014)中也对铜绿假单胞菌有严格规定(250 mL水样中不得检出)。但我国市政供水执行的国家标准《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)和上海地方标准《上海市生活饮用水水质标准》(DB 31/T 1091-2018)中均未对铜绿假单胞菌限定。鉴于铜绿假单胞菌在饮用水中的广泛检出,梳理了铜绿假单胞菌的特性、检测方法,及其在供水系统和包装饮用水中的分布特征,提出铜绿假单胞菌污染的主因与防控措施。

铜绿假单胞菌是专性需氧菌,生长温度范围25～42 ℃,最适生长温度为25～30 ℃,在4 ℃及以下几乎不生长。因此,在适宜的温度下利用其在专性培养基上能产生水溶性的色素,如绿脓素与带荧光的水溶性荧光素等可加以鉴别^[9]。现行包装饮用水和天然矿泉水标准中铜绿假单胞菌的检测采用滤膜培养法。将250 mL水样用孔径为0.45 μm的滤膜过滤,并将滤膜移至假单胞菌CN选择性培养基上,于36 ℃±1 ℃恒温箱中培养48 h。典型菌落能够在CN选择性培养基上生长并产生绿脓菌素,或者能够在溴化十六烷基三甲铵选择性培养基上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光360 nm±20 nm照射下能发荧光,能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌,经证实为铜绿假单胞菌,则其检测结果为阳性^[13]。但该方法耗时长^[14],滤膜培养及后续验证试验总共需7 d以上。此外,培养法不能检测出在环境胁迫下变得不可培养(Viable But Non-Culturable, VBNC)的细菌。研究表明^[15],水处理工艺中广泛使用的紫外线消毒能诱导铜绿假单胞菌进入VBNC状态。因此采用滤膜培养法可能低估了样品中的铜绿假单胞菌数量。

聚合酶链式反应(PCR)是一种鉴定细菌有效的分子生物学方法,可以提高铜绿假单胞菌检测的速度,且具有很好的特异性和灵敏性^[16]。水样经过滤提取基因组DNA后,在特异性引物与DNA聚合酶的作用下,经“变性、退火、延伸”3个反应多次循环,使目的基因迅速扩增,经琼脂糖凝胶电泳定性验证。Felföldi等^[17]运用该方法检测铜绿假单胞菌体内的特异性基因片段(16S rDNA)。接着,Lu等^[18]建立了荧光定量PCR(qPCR)方法检测了美国管网水中的包括铜绿假单胞菌在内的6种致病菌,检测限高达1个/反应体系,能准确定量且耗时较短。

Zhang等^[19]建立了环介导等温扩增方法对瓶装饮用水中铜绿假单胞菌进行检测,检测限低至3.1 CFU/250 mL。不同于PCR扩增方法,环介导等温扩增法无需变性退火等程序,操作更简便,且检测结果肉眼可见。Kim等^[20]建立了荧光团标记法对饮用水中铜绿假单胞菌进行定量检测,方法检测限低至5.07个/mL。此外,Yilmza等^[21]建立了拉曼光谱结合主成分分析方法对饮用水中铜绿假单胞菌进行定性检测,该方法无需扩增、标记等步骤,检测速度快,分析时间可缩短至15 min。

总的说来,滤膜培养法与PCR/qPCR法是目前饮用水中铜绿假单胞菌检测应用最普遍的两种方法。PCR/qPCR方法快速、灵敏、检测限低,在数小时内可以完成测定。但一方面,细菌死亡之后基因在一定时间内仍然会残留,因此,该方法检测的结果有可能高估了铜绿假单胞菌在水中的健康风险^[17]。另一方面,由于qPCR方法需富集几升至几十升的水样以提取基因组DNA^[18],应用中受到了一定的限制。而滤膜培养法虽耗时长,但操作简便,成本低,不需要使用贵重仪器。通常只需要250 mL水样过滤后在专性培养基上培养后进行菌种验证,是相关水质标准中的推荐方法。

天然水环境是铜绿假单胞菌的重要生存场所,地表水(包括河流、水库)和地下水(天然矿泉水)中均广泛存在铜绿假单胞菌。新加坡某水源水库^[22]和埃及河流^[23]中铜绿假单胞菌的调查显示,水样阳性检出率分别为66.40%和22.20%。Wu等^[24]调查了我国广州地区各水源地铜绿假单胞菌的污染情况,地表水和地下水的阳性检出率分别为36.4%和27.8%。我国南方地区12个不同城市矿泉水的调查显示,水源水中铜绿假单胞菌的阳性检出率为24.44%,成品水中也有检出(10.00%)^[25]。

因而,若生产环节中对上游水源水中的铜绿假单胞菌去除不够充分,则可能带入到产品水当中。近年来,国内外包装饮用水中均发现了不同程度的铜绿假单胞菌污染。Vantarakis等^[26]在1995～2000年期间对希腊29家市售瓶装饮用水公司的1 860个样品进行了分析,其中铜绿假单胞菌的总检出率为6.10%,但覆盖面较广,只有9个品牌(31.03%)的水样没有铜绿假单胞菌检出。Georgieva等^[14]调查了2000～2013年期间保加利亚2 500个瓶装饮用水样品,有274个样品(检出率10.96%)为铜绿假单胞菌阳性结果,更为重要的是这些铜绿假单胞菌均表现出耐药性(Drug resistance)。该研究的作者由此建议免疫力受损的人群、幼儿及老年人应尽量少饮用瓶装水。

我国包装饮用水(瓶装/桶装)中铜绿假单胞菌检出的报道较多^[27,28,29]。漯河市不同场所的桶装饮用水调查结果显示,公共场所(车站、学校等)样品的阳性检出率(14.70%)高于企业、超市、便利店等地^[27]。广州市包装饮用水中铜绿假单胞菌的调查结果显示,桶装水的检出率为8.80%,而瓶装水中未检出;纯净水检出率(6.30%)高于矿泉水(2.40%)^[29]。从桶装水检出率高于瓶装水的调查结果可以推测,很可能源自水桶的反复使用中消毒不彻底,导致受污染。因此,应该加强相关企业的生产过程监管,特别是加工环境、设备及操作人员的清洁管理,注重产品包装在循环使用中的充分消毒,才能保障饮用水产品的质量安全。

虽然在供水系统中大多通过余氯作为消毒剂控制管网水质,但供水体系中铜绿假单胞菌检出的报道也时有发生。2010年,Felföldi等^[17]使用PCR方法检测了尼日利亚某供水系统包括管网水中的铜绿单胞菌,检出率为7%。Schiavano等^[30]调查了235个来自居民住宅的自来水样品,铜绿假单胞菌的阳性检出率为2.13%。同时,利用RAPD技术(随机扩增多态性DNA)对分离到的铜绿假单胞菌菌株进行遗传亲缘分析,结果发现具有相同RAPD图谱的菌株都是在同一年甚至不同年份从同一地点分离出来的。这一结果表明,整个供水体系能被一个铜绿假单胞菌菌株长期定植。

我国生活饮用水中铜绿假单胞菌检出的报道较少。早在1993年,我国大同铁路卫生防疫站在生活饮用水中检出2株铜绿假单胞菌,这是我国生活饮用水中首例铜绿假单胞菌检出的公开报道^[31]。2012年,成都市疾病预防控制中心采集了成都市城区内756个生活饮用水样品,包括管网水和二次供水,其中二次供水与管网水中铜绿假单胞菌的检出率在夏季最高,为10.20%和0.80%,而冬季检出率最低^[32]。由于铜绿假单胞菌并不是现有国家标准(GB 5749-2006)中的指标,可能一定程度上低估了检出率。Lefebvre等^[33]的研究表明,铜绿假单胞菌的检出与当季平均气温升高有关。根据铜绿假单胞菌的生长特性,其能在较高温度下生长(42 ℃),而在低温下(4 ℃)不能存活。类似的,其他研究中也观察到革兰氏阴性菌与高温或夏季存在一定的关联^[34,35]。因此,铜绿假单胞菌在饮用水中的存在很有可能与温度有关,在温度较高的夏季更易于检出。

同时,一些研究表明铜绿假单胞菌与水的理化参数之间没有明显的关联性。铜绿假单胞菌是管道生物膜中的优势菌种,细菌可随水流冲刷进入水中^[36,37,38]。Ghazlane等^[39]从管网水中分离培养到了铜绿假单胞菌,并探究了其在聚乙烯材质的管壁上的粘附性能及生物膜形成的影响因素,从试验上证明其能够附着在管壁上存活。Qin等^[40]和Lu等^[41]调查了供水系统蓄水箱中的水和沉积物中致病菌污染情况,50%的水样和22.2%的沉积物中有铜绿假单胞菌检出,认为底部沉积物是其疑似来源。这些研究都表明,管壁、池壁的清洗和消毒管理是铜绿假单胞菌污染控制的重要环节。

医院供水系统中的铜绿假单胞菌污染较为严重。这可能与病患携带的病菌造成医院环境与设备的外源污染有关^[42]。Asghari等^[43]对伊朗11家医院自来水调查结果表明,32%的自来水存在铜绿假单胞菌污染。Cohen等^[44]在2017年调查了医院自来水样和病人体内的铜绿假单胞菌,并利用分子生物技术证明了水龙头受到污染是人体感染铜绿假单胞菌的主要原因。Hutchins等^[45]发现医院自来水龙头装置上有长期存活的生物膜,生物膜中的铜绿假单胞菌使得自来水受到污染。

表1汇总了自2000年以来,国内外报道的不同地区各饮用水体中铜绿假单胞菌的检出率/检出量与检测方法。

将表1中不同来源(包括水源水、水厂、供水系统、自来水、包装饮用水)的水样中铜绿假单胞菌的检出率进行对比分析。虽然源自不同的研究,但仍呈现一定的规律性。图1所示,不同类型水中铜绿假单胞菌的检出率存在较大差异。水源水中检出率最高。水库、河流、矿泉水等地表水,以及地下水中铜绿假单胞菌的检出率均大于20%。其次是医院自来水,由于受到病源污染,其检出率均大于10%。但在居民住宅饮用水中的检出报道较少,且检出率较低(2.18%)。自来水厂水受铜绿假单胞菌污染的报道只有1例,其出水口样品检出率只有0.2%,说明水厂处理工艺基本能够有效去除铜绿假单胞菌,这与Wang等^[51]51]的研究是一致的。但供水管网和二次供水系统中污染情况增加,如一项研究表明蓄水箱检出率高达50%。这与蓄水池中水停留时间较长、消毒剂残留过低有关。笔者近期调查上海某小区的二次供水系统,也有少量的铜绿假单胞菌检出(检出率11.90%),而相对应的市政供水中则未检出。此外,包装饮用水中铜绿假单胞菌的检出报道较多,有两例检出率较高(接近40%),另外4个研究中其检出率均在5.10%～10.96%。

总体而言,铜绿假单胞菌在水源水(地表水、地下水)中存在较为普遍,但经过水处理工艺后检出率均大幅度降低。依据现有报道,与包装饮用水相比,城市供水系统中检出率较低。医院自来水系统是铜绿假单胞菌污染高发区,应引起重视。

近年来饮用水中铜绿假单胞菌的研究逐渐升温。为数不多的研究表明,温度是影响铜绿假单胞菌在饮用水中检出的一个重要因素。在高温或夏季铜绿假单胞菌更易检出。而铜绿假单胞菌的污染源呈现多样化,有可能来自水源水中未除尽的部分在管网中沉积繁殖;或在二次供水环节受到外源污染(医院);也有可能在直饮水装置(水龙头、桶)环节因消毒不彻底而滋生生物膜导致铜绿假单胞菌污染。

当前,随着高品质、优质饮用水的推广,我国生活饮用水中铜绿假单胞菌的研究亟待深入,需要开展新型检测、溯源分析、控制策略等多方面的基础研究工作,通过试验了解铜绿假单胞菌在管壁、池壁上的生长习性及在生物膜中的竞争生长特征,并全面摸查铜绿假单胞菌在供水体系中的分布特征与影响因素,对其进行有效防控。