生物脱氮技术(biological nutrient removal,BNR)长久以来作为最行之有效、经济节约的处理方法得到了广泛应用,也是当前水处理研究领域的一个重要方向^[1]。然而,我国污水处理厂(wastewater treatment plants,WWTPs)目前普遍面临着进水碳源不足的问题,即进水C/N<5^[2,3],这使得我国多数WWTPs的脱氮性能难以得到进一步提升。随着我国水体治理的稳步推进,WWTPs势必将面临更严格的出水水质标准,这其中氮的降低至关重要。因此,能降低碳源需求的新型BNR工艺近年来成为众多学者的研究热点。

随着分子生物学的引入及数学模型的不断完善,BNR工艺也得以深入研究,从此科研工作者们提出了一系列的新理论,并以其为指导开发了许多新型BNR工艺。例如,有些微生物能够在有氧条件下进行反硝化作用^[4];在同一反应器的好氧环境当中,硝化作用与反硝化作用可以同时发生;更甚者发现NH₃-N在缺氧环境下与硝酸盐(NO^-₃-N)或亚硝酸盐(NO^-₂-N)反应生成氮气^[5]。这些发现都超出了传统BNR的理论界限。目前,在工艺应用领域的研究多集中在短程硝化反硝化生物脱氮工艺(partial nitrification-denitrification,PND)^[6]、同步硝化反硝化生物脱氮工艺(simultaneous nitrification-denitrification,SND)^[7]以及厌氧氨氧化脱氮工艺(anaerobic ammonium oxidation,Anammox)^[8]等。

针对新型BNR工艺的研究多是基于实验室规模的序批式反应器(sequencing batch reactor,SBR)^[9],所处理水质也多采用人工配水模拟城市污水,虽然在短程硝化的实现途径与控制措施等方面取得了丰富的研究成果,但由于我国当前大约90%的WWTPs采用连续流工艺,而AO及AAO工艺占比更是在一半以上^[10],因此在AAO系统中研究新型BNR工艺具有重要的现实意义。基于此,本文以低C/N(<5)实际城市生活污水为研究对象,在已实现PND的AAO中试反应器好氧区中投加生物填料,探究活性污泥-生物膜复合系统在AAO系统中的脱氮增效机制,为实现AAO系统深度脱氮奠定理论基础。

中试反应器的平面示意图如图1所示。AAO中试反应器的整体尺寸为长3.7 m,宽1.5 m,高2.0 m,有效容积为7.8 m³,其中厌氧池有效容积为0.9 m³,沉淀池与浓缩池为1.5 m³,缺氧与好氧池有效容积为5.4 m³;反应器内缺氧与好氧区之间设置一系列挡板卡槽,其分区比例可通过改变挡板位置进行调整,并可满足V_缺∶V_好=1∶2、V_缺∶V_好=1∶1和V_缺∶V_好=1.5∶1的3种比例下的调控;通过对隔板上下开孔的方式,保证了反应器内部污水的流态;好氧区底部布设微孔曝气管,能够满足搅拌、曝气两种要求;进水及内外回流的流量通过电磁流量计控制,曝气量采用高精度气体转子流量计调节。

本研究选用的生物填料为鲍尔环改性生物悬浮填料,规模为ϕ25×10 mm,有效比表面积>500 m²/m³,有益于微生物的着床固定化、以及固定化种群在载体上的增值与代谢,同时附着力强不易脱落,表面亲水性能良好。该填料挂膜前比重为0.96～0.98 g/cm³,挂膜后约等于1.0 g/cm³,其综合性能可满足本试验研究要求。维持系统MLSS为(3 500±200)mg/L,按照填充率15%的比例,向好氧区投加悬浮填料。根据系统运行参数、好氧区有效容积和生物填料尺寸,计算出共计投加悬浮生物填料约55 000枚,折合质量约为25 kg。

中试反应器的进水为西安市某污水处理厂曝气沉砂池的出水,该城市污水处理厂的处理规模为20万m³/d,采用的污水处理工艺为传统AAO工艺,其进水水质如表1所示。反应器活性污泥取自该污水处理厂好氧池的活性污泥,污泥维持了较高的活性,经过30 d的驯化与适应,系统对各项污染物的去除性能趋于稳定状态。

NH₃-N、NO₃^--N、NO₂^--N和TN浓度的测定方法均采用标准方法^[11]。DO、pH和水温监测均采用哈希公司WTW多功能自动测定仪。微生物DNA的提取和测序方法参见文献[12]。

采用扫描电子显微镜(SEM)对生物膜样品进行分析,SEM型号为JSM-6510LV。样品预处理方法为:裁剪载体填料中心区域制备5 mm×5mm的测定样品片,并将附着有生物膜的样品置于玻璃培养皿中,使生物膜全部浸泡于4%的多聚甲醛溶液中,固定6 h;使用不同浓度梯度的乙醇溶液对固定好的生物膜进行淋洗,洗脱梯度为30%、50%、70%、80%、90%、100%,每个梯度洗脱15 min;将洗脱后的生物膜先于乙酸异戊酯∶乙醇=1∶1的溶液中置换5 min,再于100%乙酸异戊酯的溶液中置换5 min;去除置换后生物膜的上清液,将其转移到干净培养皿中风干。将风干后生物膜通过SEM进行观察。

中试反应器持续运行80 d,共分为以下3个阶段:阶段1(0～15 d),挂膜初期;阶段2(16～40 d),生物膜快速生长期;阶段3(41～80 d),活性污泥-生物膜复合系统稳定成型期。整个试验过程中,进水流量控制在0.5 m³/h,HRT为15.6 h,温度采用恒温器维持在(25±1)℃。反应器的其他工况参数如表2所示。

短程硝化效率通常采用亚硝酸盐积累率(NAR)进行表征,含义是好氧区出水中 NO₂^--N浓度占NO₃^--N与NO₂^--N浓度之和的百分比^[9]9]。见式(1):

${\rm N}AR=\frac{{\rm N}{\rm O}{}_{2(\text{好}\text{出})}^{-}}{{\rm N}{\rm O}{}_{2(\text{好}\text{出})}^{-}+{\rm N}{\rm O}{}_{3(\text{好}\text{出})}^{-}}\times 100\%(1)$

式中 NO₂^-_(好出)——好氧区出水NO₂^--N,mg/L;

NO₃^-_(好出) ——好氧区NO₃^--N浓度,mg/L。

同步硝化反硝化效率(SND)用以表征好氧区同步脱氮性能^[6]6]。为了简化测定过程,一般认为氮在缺氧区已彻底完成氨化过程,即好氧区进水中不含有机氮,NH₃-N不存在升高的趋势,此时同步硝化反硝化效率计算见式(2):

$S{\rm N}D=[1-\frac{{\rm N}{\rm O}{}_{x(\text{好}\text{出})}^{-}-{\rm N}{\rm O}{}_{x(\text{好}\text{进})}^{-}}{{\rm N}{\rm H}{}_{4(\text{好}\text{进})}^{+}-{\rm N}{\rm H}{}_{4(\text{好}\text{出})}^{+}}]\times 100\%(2)$

式中 NO^-_x(好进)——好氧区进水NO_x^--N,mg/L;

NO^-_x(好出) ——好氧区出水NO_x^--N,mg/L;

NH⁺_4(好进) ——好氧区进水NH₃-N,mg/L;

NH⁺_4(好出) ——好氧区出水NH₃-N,mg/L。

微生物由于个体较小、代谢作用微弱,只有当微生物达到一定数量的集群出现时,方可发生显著作用^[13]13]。因此,应首先探究挂膜期间填料表面附着微生物的生物量随挂膜时间的变化规律。为降低取样偶然性及试验误差,每次取样均从好氧区不同位置分3次捞取生物填料,并从每批次样品当中随机选取10枚,将选出的30枚生物填料混合后测定其附着生物量。测定结果如图2所示。

从图2中可以看出悬浮填料表面附着的生物量随挂膜时间的变化呈“S型”曲线。填料投加前2～3 d,表面基本没有微生物附着,生物量接近于零;其后3～7 d微生物开始在填料表面缓慢富集,生物量略有增长;第7 d测定结果显示,填料附着生物量为2.62 mg/g;随后,生物量呈快速增加趋势,其中第7～15 d,填料表面生物量近似以1.07 mg/(g·d)的速率增长;其后每5 d测定一次,15～40 d共划分为5个取样周期,每个取样周期内生物量的日增长速率分别为1.72、1.38、1.04、0.61和0.52 mg/(g·d),就生物量增长速率而言,第15～40 d属于填料生物膜快速生长时期,也是挂膜启动SND的关键时期;自40 d以后,生物量增长速率逐渐放缓,虽略有增加,但增长效果不明显;40～60 d内单位质量填料上生物量仅增加3.56 mg/g,最终稳定在39.51 mg/g。

为了更为直观地从微观角度探究填料载体表面生物膜的生长状况,通过SEM分析载体表面生物膜结构的生长变化情况,其形态结构如图3所示。从图3中可以看出,随着挂膜时间的延长,载体表面附着生长的微生物急剧增加,这与宏观生物量的测定结果一致;同时在生物膜生长的前期,微生物在填料表面呈孤岛式集群分布,而后期随着微生物的后续粘附及生长,生物膜快速富集,其内部相互交叉重叠呈现出不规则的网状结构,其比表面积得到极大程度的增加,进而增大其与活性污泥液相主体的接触概率,降低传质阻力对生长的限制作用。

基于该反应器的前期研究,在V_缺∶V_好=1∶1、好氧区DO=0.5～0.8 mg/L和SRT=12 d的工况下,该AAO中试反应器可在36 d内实现PND,且系统稳定后NAR最高可达62.64%,NH₃-N与TN的去除率最高分别可达95.1%和83.9%,出水浓度最低分别可降至1.46 mg/L和9.00 mg/L^[15]15]。本次研究在以上工况及脱氮性能的基础上,通过对系统好氧区投加生物填料来建立活性污泥—生物膜复合系统,以期在AAO系统中进一步实现深度脱氮的目的。系统对NH₃-N和TN的去除情况如图4所示。

从图4a中可以看出,阶段1系统对NH₃-N的平均去除率为94.33%,出水平均浓度为1.84 mg/L。此时对NH₃-N起到降解作用的微生物为活性污泥中的菌胶团,受到系统SRT的影响,对SRT要求较长的硝化菌群活性难以进一步提高,因此限制了系统对NH₃-N去除效率的进一步增长。阶段2系统对NH₃-N的平均去除率增至97.14%,出水平均浓度降为1.00 mg/L。随着生物填料表面微生物的大量富集,生物膜也参与到生化反应过程中,且延长了部分污泥的SRT,使得硝化菌群得以富集,从而进一步提升系统硝化性能。阶段3随着活性污泥-生物膜复合系统稳定成型,反应器的硝化性能也趋于稳定,该阶段系统对NH₃-N的平均去除率为97.90%,出水平均浓度为0.67 mg/L。

从图4b中可以看出,得益于系统对NH₃-N去除效率的提升及生物膜中缺氧微环境的逐步形成,系统对TN的去除性能增长明显。三阶段系统对TN的平均去除率分别为79.40%、83.40%和86.53%,出水平均浓度分别为10.23 mg/L、8.57 mg/L和6.48 mg/L。活性污泥—生物膜复合系统稳定形成后,反应器的脱氮效率与挂膜初期相比增加7.13%,反应器出水总氮浓度稳定在8.0 mg/L以下,深度脱氮效果显著。活性污泥—生物膜复合系统中富含充足的缺氧微环境,相当于在对好氧区HRT无影响的条件下,利用生物膜填料巨大的表比面积延长了缺氧区的HRT,使得反硝化作用更加充分;同时活性污泥—生物膜复合系统与单纯增加缺氧池容积相比,具有硝化产物直接利用的特点,对于反硝化过程而言更为方便快捷;此外,生物膜内部反硝化的碳源主要依靠生物膜自身微生物老化衰亡裂解所释放的细胞衍生物及活体细菌的内碳源,因此其相对于缺氧区的反硝化过程而言,可以有效节约污水当中的碳源,进而提高了系统整体的脱氮效率,同时降低污泥产率。

不同阶段下NH₃-N和NO_x^--N在反应器内的沿程变化如图5所示。

从图5a中可以看出,除了反应器的稀释作用,NH₃-N主要在系统好氧区内去除,通过N物料衡算可以得出,系统在阶段1～阶段3好氧区内NH₃-N的去除量分别占总去除量的17.14%、18.57%和23.41%。与前期研究好氧区内NH₃-N去除量(14.39%)相比,活性污泥-生物膜复合系统稳定成型系统好氧区对NH₃-N的去除性能增长62.68%,其硝化性能增长显著。从图5b中可以看出,NO_x^--N的去除主要是通过系统缺氧区中传统反硝化作用。通过好氧区NO_x^--N变化规律可以看出,3个阶段下好氧区NO_x^--N的生成率呈降低趋势,其值分别为78.42%、64.36%和51.22%。分析原因是随着活性污泥—生物膜复合系统的稳定成型,好氧区内部的缺氧微环境比重也在增加,这为SND的形成创造了有利的条件。因此,部分NH₃-N通过硝化作用转化为NO_x^--N的同时,生物膜内缺氧微环境中发生的反硝化作用又将这部分NO_x^--N转化为N₂排出,这便造成了NO_x^--N生成率降低的趋势。

为了探究活性污泥—生物膜复合系统脱氮途径,在整个试验期间以好氧区为研究对象,对其进出水中富含的各种形态N浓度进行检测分析,结果如图6所示。

从图6a中可以看出,投加填料后形成的活性污泥—生物膜复合系统,对PND具有一定的促进作用。系统阶段1的平均NAR为61.57%,略低于先前研究的62.64%。其后,随着生物量的快速增长,系统阶段2的平均NAR增至65.19%,这主要得益于活性污泥中微生物菌群对活性污泥-生物膜复合系统适应性能的提高,系统NAR逐渐恢复并高于先前研究值;此后,生物膜微生物参与系统氮素转化的比重增加,在生物膜内部由于传质阻力作用,DO分布不均现象更为明显,对生物膜的微生物菌群分布再次进行筛选,造成对DO需求较低的AOB富集程度进一步提高,而NOB抑制作用较液相主体菌胶团而言更加显著,从而提高了系统PND作用。试验后期,系统NAR波动较大,但整体稳定在67.48%。

从图6b中可以看出,阶段1系统好氧区的平均SND效率约为21.57%,这是由于好氧区DO浓度较低(0.5～0.8 mg/L),活性污泥菌胶团因为自身结构等原因形成了内部缺氧微环境,促成了部分SND的发生。其后,SND效率在阶段2呈现快速升高趋势,该阶段平均SND效率为35.64%。这是因为生物膜表面硝化菌群产生的NO_x^--N会在浓度梯度作用向膜内传递,同时液相中的部分硝化产物也会扩散进入生物膜内部,随着生物膜内部DO浓度的降低,聚集于此微生物多为专性或兼性厌氧菌,包含大量的反硝化菌群,能够利用NO_x^--N完成厌氧呼吸,当生物膜环境中的碳源含量较低时,部分反硝化菌能够消耗自身碳源完成反硝化过程^[14]14],因此该阶段SND显著提高。随着活性污泥-生物膜复合系统的成型,SND效率也趋于稳定,最终在46.28%左右达到饱和状态。另外,根据理论分析^[15]15],此时在生物膜内部存在着广阔的厌氧环境,且具备NO₂^--N及NH₃-N等基质条件,因此可能诱导部分Anammox细菌的产生,对于系统脱氮性能的提升做出一定的贡献。综上所述,AAO系统中活性污泥—生物膜复合系统的形成,可在PND成功启动的情况下进一步提高NAR,同时随着生物膜的稳定成型,系统SND的效率也得到进一步的提升,从而实现系统进一步深度脱氮的目的。

为验证活性污泥-生物膜复合系统对AAO工艺强化生物脱氮的作用机理,采用高通量测序方法对生物膜样品的微生物种群进行测定,以解析其菌群结构。取活性污泥-生物膜复合系统稳定成型后的生物膜(60 d),并对其进行16S rRNA扩增测序分析。

图7为门水平下第60 d的生物膜样品微生物相对丰度饼图。从图中可以看出,第60 d物膜上微生物在门水平上主要包括:Proteobacteria(75.28%)、Bacteroidetes(5.34%)、Planctomycetes(3.06%)、Chloroflexi(2.62%)和Firmicutes(2.54%)。其中Proteobacteria的相对丰度占据绝大多数,是生物膜系统的主要优势菌。这与大多数前人在城市生活污水处理系统中的研究结果相符,其中蒋柱武等^[16]16]测定二沉池回流污泥中Proteobacteria的相对丰度为49.62%;Hu等^[17]17]采用454聚磷酸盐测序的方法对我国12座市政污水处理厂研究结果表明,Proteobacteria在各污水处理厂中的门水平相对丰度均为最高。因此,Proteobacteria显著的种群基数是其能够成为生物膜优势菌的首要原因;其次,就结构特性分析,所有的Proteobacteria细菌均为革兰氏阴性菌,其外膜的主要成分为脂多糖,该物质具备一定的粘性,易于聚团附着生长,为其在填料载体上着床提供一定的物质条件^[18]18];此外,对生长习性分析,Proteobacteria大多数细菌为兼性或专性厌氧异养型,因此固相传质阻力造成的生物膜内部DO含量较低的微环境进一步为其富集生长提供便利。根据文献显示,Proteobacteria尤其是其中的β- Proteobacteria纲在污水脱氮除磷过程作用显著,该菌纲的部分菌属与反硝化作用直接相关^[19]19]。

为进一步研究活性污泥-生物膜复合系统中脱氮增效微生物,对微生物种群进行属水平分析,其结果如表3所示。从表中可以看出,生物膜中微生物相对丰度在5%以上的属包括:Thauera(12.31%)、Comamonas(7.21%)和Zoogloea(7.18%);相对丰度在2%～5%的菌属包括:Dechloromonas(4.47%)、Azospira(2.44%)、Gemmatimonas(2.56%)、Thermothrix(3.49%)和Denitratisoma(2.54%);相对丰度在1%～2%的菌属包含11类(表中未列出),其中多数为Proteobacteria的菌属,部分为Firmicutes与Bacteroidetes。就特定功能菌分析,本系统中检测出Nitrosomanas(1.28%)和Nitrosococcus(1.54%)这两种常见的AOB,而NOB的含量微乎其微,表明载体生物膜在延长系统HRT的同时通过低DO筛选机制,选择性地保留AOB而淘洗NOB,从而使得系统的短程硝化作用增强。另外,Thauera^[20]20]、Dechloromonas、Comamonas、Zoogloea^[21]21]和Denitratisoma为系统中主要的典型反硝化菌属,其相对丰度之和为33.71%,从而保证了短程硝化产物NO₂^--N在生物膜内部及时去除,提高系统的SND效率。此外,有研究表明Gemmata(0.96%)、Pirellula(0.14%)和Aquisphaera(0.38%)等菌属能够参与藻类的生物矿化和除氮过程^[22]22],因此也不能排除这3类菌属的脱氮作用。同时,测定结果显示,在生物膜内部存在Anammoxoglobus(0.57%),该菌属为Anammox作用菌^[23]23],虽然其在生物膜中的含量较少,但作为一种新型的生物脱氮功能菌值得特别关注。

(1)在AAO中试反应器好氧区DO 0.5～0.8 mg/L、HRT 4.5 h和MLSS(3 500±200)mg/L的条件下,按照填充率15%向好氧区投加生物填料,活性污泥—生物膜复合系统可在40 d 左右稳定成型,此后生物量变化较小,并稳定在39.51 mg/g。

(2)活性污泥-生物膜复合系统可将好氧区NAR和SND效率增至67.48%和46.28%,通过促进PND和SND这2种脱氮途径,使系统出水NH₃-N和TN浓度分别降至0.67 mg/L和6.48 mg/L,对系统脱氮增效作用显著。

(3)活性污泥-生物膜复合系统稳定成型后,生物膜上微生物以Proteobacteria主要优势菌(75.28%);从属水平的微生物群落结构分析发现生物膜系统对AOB具有一定的富集作用,主要的AOB菌属为Nitrosomanas(1.28%)与Nitrosococcus(1.54%),同时典型反硝化作用的微生物菌属占比显著(33.71%);并且在生物膜中存在少量Anammox菌群(Anammoxoglobus,0.57%)。