随着我国城市化步伐的加快, 城市下垫面的结构与功能逐渐变化, 更多的硬化下垫面的产生改变了城市的自然水循环过程^[1]。由于降雨下渗受到阻隔, 降雨径流冲刷各类下垫面, 携带大量的污染物质汇入城市河湖, 成为城市河湖水系污染的重要原因之一^[2]。透水铺装是一种能有效削减径流量, 净化水质的低影响开发措施, 具有良好的源头控制功能^[3]。同时对改善开发场地的水文及水质状况有显著的作用, 已逐渐为人们所关注^[4]。

　　 嵌草铺装是常见的透水铺装之一, 具有减少径流污染物负荷、增强雨水下渗、保护地下水资源等功能, 越来越多地应用在城市人行道路、停车场、公园等。嵌草铺装系统是由植物、土壤和填料结构组成的系统, 城市径流雨水在嵌水铺装系统中的净化机理包括土壤及植物根系的物理过滤、化学反应以及微生物对污染物降解等过程, 多种因素都会对污染物的去除效果产生影响。

　　 本试验为保持试验材料的一致性, 避免天气条件的影响, 选择室内模拟的方法使试验结果更具一致性。试验从嵌草铺装系统的结构、功能和机理出发, 研究在嵌草铺装系统去除雨水径流中NH₃-N、TN、TP和COD过程中微生物的群落结构和多样性变化, 探讨微生物在嵌草铺装系统中的贡献以及作用机理。

　　 由于嵌草铺装系统的净化作用主要依靠砖孔中的土壤和植物, 以及面层下部的透水结构层填料。因此, 本试验只模拟砖孔纵向结构。试验装置 (见图1) 是由有机玻璃和PVC排水管制成的方形箱体结构, 开孔40 mm×40 mm, 总高450 mm。自下而上填装物分别为砾石、级配砂石、中砂、种植土和植物, 装置上方配有人工光源, 以确保植物的正常生长。

　　 试验用水由KNO₃、NH₄Cl、KH₂PO₄、葡萄糖试剂与去离子水混合配置而成。参考北京市实测道路雨水径流污染物数据^[5], 配置进水, 指标如下:NO₃^--N 5 mg/L、NH₃^-N 5 mg/L、TN 10 mg/L、COD 150 mg/L、TP 1 mg/L。

　　 试验开始前, 使用去离子水对每个装置淋洗一周, 模拟嵌草铺装系统结构层的饱和过程 (填料沉降等) , 并且淋洗掉土壤和填料上的盐分 (氨氮、硝氮等) 和不稳定有机物, 以免干扰试验数据。经测定, 淋洗一周后出水水质NO₃^--N、NH₃-N和TP浓度分别小于0.3 mg/L、0.2 mg/L和0.05 mg/L, 满足试验要求。

　　 试验共使用8个过滤柱, 置于温室中, 并安装玻璃窗, 确保植物生长所需的光源并且保证每个过滤柱的水和污染物的量受到试验控制。植物种类试验中土壤pH调整为7.17, 试验分为2组, 分别种植牛筋草 (E7) 和丹麦草 (L7) 。试验共进行12 d, 分别在第2 d、5 d、8 d、12 d进行取样。从出水口收集所有渗滤水测得体积并搅拌均匀, 取100 mL渗滤水过滤待测。采用哈希DR6000紫外可见光光度计测定渗滤水中的NH₃-N、TN、TP和COD的浓度。采用高通量测序技术检测细菌16SrDNA的分子序列, 进行微生物基因对照来分析微生物的群落结构和多样性。采用RDP classifier软件对物种分类, 将这些细菌按照门 (phylum) 、纲 (class) 、目 (order) 、科 (family) 、属 (genus) 5个层次分类。

　　 植物对于嵌草铺装系统的功能实现有着不可或缺的作用。一方面, 植物可提高生物滞留设施填料的有机质含量和反硝化效率^[6];另一方面, 植物根系的生长促进了微生物种群的繁殖, 有利于污染物的去除。从滞蓄方面考虑, 根系生长形成了基质大空隙, 防止堵塞土壤孔隙^[7]。如图2所示, 种植丹麦草和牛筋草的系统对NH₃-N的去除率分别为77.4%、74.8%, 对TN的去除率分别为79.4%、78.7%, 对TP的去除率分别为78%、75%, 对COD的去除率分别为92.7%、95.3%。在0～2 d时, 系统内NH₃-N、TN、TP和COD的浓度迅速下降, 这是因为土壤内部的吸附点位比较充裕, 能将大量的污染物吸附, 因而土壤的吸附、过滤作用比较显著。随着吸附点位逐渐被占据, 土壤对污染物的吸附达到饱和, 所以去除率渐趋稳定。总体而言, 种植丹麦草的系统对NH₃-N、TN和TP的去除能力略高于牛筋草。Read等^[8]通过研究20多种植物对半合成雨水的生长响应, 发现拥有密集长根的植物对生物过滤柱去除磷有促进作用。丹麦草拥有较密集的根系, 因此种植丹麦草的系统除磷效果相对更好。

　　 土壤微生物对于嵌草铺装系统中径流污染物的去除有着极为重要的作用。微生物参与氨化、硝化、反硝化作用, 并且还能富集水中的磷, 从而达到脱氮除磷和去除COD的目的^[9]。由于在属层次样品间的优势菌属分布存在显著差异性, 故重点围绕属层次来分析微生物的主要菌群分布。

　　 如图3所示, 初始土壤中微生物种类在属水平下达可统计量级的超过50种, 优势菌属有Gaiella、鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonadales) 、微小杆菌属、酸杆菌属Gp16、栖热嗜狮菌属 (Thermoleophilum) 、酸杆菌属Gp6, 所占比例分别为8.20%、5.96%、5.10%、4.26%、4.24%、3.93%。初始土壤中柠檬酸杆菌属 (Citrobacter) 含量为3.38%, 不动细菌属 (Acinetobacter) 含量为2.09%, 假单胞菌属 (Pseudomonas) 和芽胞杆菌属 (Bacillus) 含量均低于0.01%。

　　 如图4所示, 种植丹麦草的系统在试验第5 d (L7-5) 和第8 d (L7-8) 和种植牛筋草的系统在试验第5 d (E7-5) 和第8 d (E7-8) 的土壤微生物种类在属水平达到可统计量级的超过40多种, 优势菌属有微小杆菌属 (Exiguobacterium) 、柠檬酸细菌属 (Citrobacter) 、不动杆菌属 (Acinetobacter) 、假单胞菌属 (Pseudomonas) 、芽胞杆菌属 (Bacillus) 。

　　 如表1所示, 在试验阶段优势菌属发生了显著更替。微小杆菌属在初始土壤中含量为5.10%, 位列第3优势菌属;试验进行5 d时, 它在种植丹麦草和牛筋草系统中, 分别增加到43.08%、37.65%, 成为绝对优势菌属;试验进行8 d时, 又分别回落到41.27%、35.11%。微小杆菌属是兼性厌氧菌, 具有嗜极性, 能还原硝酸盐。柠檬酸细菌属在初始土壤中含量为3.38%, 位列第8位;试验进行5 d时, 它在种植丹麦草和牛筋草系统中, 分别增加到21.93%、24.50%;试验进行8 d时, 分别变化为25.73%、22.2%。柠檬酸细菌属是兼性厌氧菌, 可以发酵葡萄糖产酸产气, 能将硝酸盐还原为亚硝酸盐^[10]。初始优势菌属Gaiella和鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonadales) 在第5 d和第8 d已达不到统计量级。

　　 不动杆菌属在初始土壤中含量为2.09%, 位列第9位;试验进行5 d时, 它在种植丹麦草和牛筋草系统中, 分别增加到13.83%、14.00%;试验进行8 d时, 分别变化为14.87%、12.28%。不动杆菌属能利用硝酸盐、亚硝酸盐, 将其还原成N₂O或N₂。假单胞菌属和芽胞杆菌属在初始土壤中未达到统计水平, 在试验阶段含量显著增加。在种植丹麦草和牛筋草系统中, 试验进行5 d时, 假单胞菌属分别增加到8.61%、8.54%;试验进行8 d时, 分别增加到9.18%、7.53%, 位列第4优势菌属。芽胞杆菌属在试验进行5 d时, 分别增加到5.00%、5.57%;试验进行8 d时, 分别回落到3.55%、3.48%, 位列第5优势菌属。这是因为假单胞菌属和芽胞杆菌属都可以通过消耗有机氮、铵态氮等生成亚硝酸盐、硝酸盐, 降低水体氨氮值, 减少氮素污染。而且它们在自然界中受外界环境影响小, 生长速率快, 能耐受酸性环境且活性高^[11]。

　　 不动杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属是异养硝化细菌, 同时又具有好氧反硝化功能, 能利用硝酸盐、亚硝酸盐, 将其还原成N₂O或N₂, 这突破了传统厌氧反硝化的认识。Ricgardson等指出细菌兼具好氧反硝化及异养硝化功能, 主要是有3类酶参与了亚硝酸盐的形成, 分别是中性粒细胞碱性磷酸酶 (neutrophilic alkalinephos-phatase, NAP) 、氨单加氧酶 (Ammonia monooxygenase, AMO) 、羟胺氧化酶 (Hydroxylamine oxidase, HAO) ^[12]。先由AMO催化铵氧化, 得到羟胺, 然后HAO催化进一步氧化得到亚硝酸。

　　 综上所述, 作为优势菌属的微小杆菌属 (Exiguobacterium) 、柠檬酸细菌属 (Citrobacter) 、不动杆菌属 (Acinetobacter) 、假单胞菌属 (Pseudomonas) 和芽胞杆菌属 (Bacillus) 都属于反硝化聚磷菌 (Denitrifying Phosphorus Accumulating Organisms, DNPAOs) , 兼有脱氮和除磷特性^[13]。这5种微生物在微生物菌群中的含量变化与嵌草铺装系统中NH₃-N、TN、TP的浓度变化呈高度正相关。

　　 Alpha多样性可以表示微生物群落的丰度和多样性。OUT值表示样品的丰富度指数, 测序结果中OUT数介于1 210～9 282;Chao指数是度量物种丰富度的指标, 测序结果Chao指数介于6 336～26 145, 表明样品中的丰富度较好, 详见表2。香农指数 (Shannon) 和辛普森指数 (Simpson) 分别表示样品中物种的均匀度和多样性。结果表明:香农指数大小排序为E7-8>E7-5>L7-5>L7-8; 辛普森指数大小排序为L7-8>L7-5>E7-5>E7-8, 说明E7-8样品的均匀度最好, L7-8样品的均匀度最差;L7-8样品多样性最小, E7-8样品多样性最大。

　　 Beta多样性指标表示不同群落间物种组成的差异, 能够衡量样本间物种组成的相似度。如图5所示, 在属水平上聚类树分析中, 越相似的样品会越靠近, 可以更直观地看出样本间的相似程度。微生物生长条件越接近, 差异性就越小, 其中L7-5与E7-5相距较近, 而L7-8与E7-8相距最远, 物种丰度差别最大。表明随着反应的进行, 种植两种不同植物的嵌草铺装系统中的微生物物种差异性变大, 植物对微生物多样性的影响更加明显。

　　 植被通过影响土壤环境, 从而影响土壤微生物群落的结构和多样性。由表1可见, 试验进行8 d时, 种植丹麦草的系统中, 作为优势菌属的微小杆菌属、柠檬酸细菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属含量均高于种植牛筋草系统中的菌属含量。试验进行5 d时, 种植丹麦草的系统中, 微小杆菌属和假单胞菌属高于种植牛筋草系统中的菌属含量;而柠檬酸细菌属、不动杆菌属和芽胞杆菌属略低于种植牛筋草系统中的菌属含量。前已述及, 种植丹麦草的系统对NH₃-N、TN和TP的去除效果略高于牛筋草。这也与两个系统中具有脱氮除磷功能的优势菌属含量变化一致。

　　 许多研究表明, 植物的种类不同, 其根系分泌物的组成和数量会有一定的差异, 从而影响根际微生物的种类和群落结构^[14]。丹麦草有发达的肉质根系, 因此耐旱性很好。牛筋草是深根性植物, 须根较细而稠密。Waid提出, 植被的类型是决定土壤微生物多样性变化的的主要影响因素^[15]。因为植物的凋落物和根系分泌物为土壤微生物提供营养和能量。不同的植物凋落物和根系分泌物的物理化学性状也不一样, 其分解过程中释放的有机无机物有很大的差异性, 进一步的影响微生物群落结构以及多样性。

　　 (1) 在嵌草铺装试验系统中, 种植丹麦草和牛筋草的系统在0～2天内对NH₃-N、TN、TP和COD的去除率较高, 主要是土壤吸附作用比较显著, 随着土壤吸附点位的饱和, 去除率趋于稳定。丹麦草具有较密集的根系, 所以种植丹麦草的系统对NH₃-N、TN、TP的去除效果略优于种植牛筋草的系统。

　　 (2) 在试验阶段, 种植丹麦草和牛筋草的系统中5种菌属的含量显著增加, 分别为微小杆菌属 (Exiguobacterium) 、柠檬酸细菌属 (Citrobacter) 、不动杆菌属 (Acinetobacter) 、假单胞菌属 (Pseudomonas) 、芽胞杆菌属 (Bacillus) , 这五种优势菌属均具有脱氮除磷功能, 微生物优势菌属的更替和含量变化与NH₃-N、TN、TP和COD的浓度变化表现出正相关性。

　　 (3) 在试验阶段, 种植丹麦草和牛筋草的系统中微生物的多样性发生了变化。Alpha多样性分析说明在试验进行8 d时种植牛筋草的系统中微生物群落的均匀度最好, 多样性最大。Beta多样性分析说明随着反应的进行, 种植丹麦草和牛筋草的系统中的微生物物种差异性变大。

　　 (4) 在相似的环境条件下, 种植丹麦草和牛筋草的系统中微生物的数量和分布是有差异的, 说明植物种类对微生物的群落结构及多样性有一定的影响。