贮存饮用水是人防工程、国防工程等领域以及远洋航运、抢险救灾^[1]等行动中给水保障的基础模式。贮存饮用水存储周期较长, 受贮存环境影响大, 随着消毒剂的衰减, 水中细菌会利用残存营养物质修复再生, 造成饮用水生物稳定性降低引发水质恶化等安全隐患。饮用水的生物安全日益引起人们的重视^[2], 可同化有机碳 (Assimilable Organic Carbon, AOC) 是目前被广泛用于评价和控制水质生物稳定性的指标^[3,4], 其指可以被微生物吸收直接转化成其菌体的有机碳^[5,6]。

　　 本文通过研究贮存饮用水在不同AOC条件下细菌生长情况与生物稳定性变化规律, 以期为提高贮存饮用水的生物安全性提供理论支撑。

　　 选取乙酸碳标准溶液作为试验水样, 选用自来水提取土著细菌, 模拟不同初始AOC浓度条件下贮存饮用水中的细菌生长情况。将配制的不同模拟水样接入自来水培养的土著菌, 于25 ℃恒温避光培养, 观察贮存水中细菌总数的变化规律。

　　 自来水取自南京市某大学实验楼水龙头出水。主要水质指标:余氯 (0.15±0.02) mg/L;浊度 (0.124±0.02) NTU;pH (7.6±0.1) ;TDS (0.45±0.01) ;AOC (90±10) μg Acetate C/L (先后接种法) ;细菌总数 (60±15) CFU/mL。

　　 具体操作方法如下:

　　 (1) 玻璃器皿于稀硝酸中浸泡24 h后依次用自来水、去离子水冲洗3遍, 烘干备用, 用于测定AOC的三角瓶烘干后放于马弗炉内550 ℃烘烤2 h取出备用^[7,8]。

　　 (2) 用于测定AOC的P17与NOX的接种液的方法^[7,9]具体为:取100 μL驯化的纯种菌液接入2 000 μg/L乙酸碳溶液中, 25 ℃培养5 d, 计算接种液浓度, 置于4 ℃冰箱内保存备用。土著菌接种液的制取方法:自来水中和余氯后过0.45 μm滤膜, 取50 mL滤后水于25 ℃培养5 d, 平板计数计算接种液浓度, 置于4 ℃冰箱内保存备用。

　　 (3) 将400 mg/L标准乙酸碳溶液与去离子水分别配制0 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、75 μg/L、100 μg/L乙酸碳溶液, 按照乙酸碳与矿物盐2 000∶1的比例加入0.01 mM矿物盐溶液^[10]作为模拟水样, 使有机碳源成为细菌生长的限制因素^[10]。无机盐配比如表1所示。

　　 待测水样中和余氯后, 将待测水样摇匀取1 mL于培养皿中, R2A培养基浇筑平板, 25 ℃恒温培养7 d后计数^[12]。

　　 取40 mL待测水样于50 mL三角瓶中, 中和余氯、巴氏灭菌后冷却至室温, 按照先后接种法将P17、NOX接种液接入待测水样, 接种浓度10⁴ CFU/mL, 培养至稳定期, 平板计数, 并转换为AOC值, 单位μg Acetate C/L。

　　 BRP表示水中营养所能支持细菌增长的最大潜力^[13,14]。取100 mL待测水样加入150 mL三角瓶内, 中和余氯、巴氏灭菌后冷却到室温, 接入1 mL 接种液并摇匀, 然后于恒温培养箱中25 ℃避光培养5天, 平板计数得到水样的BRP值, 单位CFU/mL。

　　 细菌的生长变化主要分为迟滞期、对数增长期、平台期与衰亡期^[15]。

　　 各水样初始BRP如图 1所示, 通过线性拟合, 发现水样初始BRP与AOC呈现较好的线性相关关系。BRP表征水样所能支持最大细菌增长潜力, 在碳为限制性因子的条件下, BRP与AOC一致性较好。

　　 基于Growth-Dose-response公式^[16]16]建立细菌增长数学模型, 如式 (1) 所示, 并通过Origin对数据进行拟合分析。

　　 $C(t)=\frac{C{}_1}{1+10{}^{p(\text{l}\text{g}t{}_0-t)}}+C{}_0(1)$

　　 式中 C——细菌浓度;

　　 lg (t₀) ——进入对数期时间;

　　 p ——生长系数。

　　 如图2所示, 随着AOC浓度增加, 细菌生长所能达到的最大值C_max相应增加, 在0～25 μg Acetate C/L以及50～75 μg Acetate C/L出现了跃升, 与Kooij等^[17]和Lechvallier等^[18]提出10～20 (不加氯) μg Acetate C/L、50 (加氯) μg Acetate C/L的生物稳定性指标是相一致的。

　　 参数lg (t₀) 表示迟滞期与对数增长期转换的节点。如图3所示, AOC浓度越高, 表明细菌生长的营养越充足, 细菌群落由延滞期到对数增长期所需要的适应时间更短, 当AOC浓度为0时, 细菌在贫营养的条件下迟滞期明显延长, 对应平台期相对延后, 在贫营养的条件下平台期相对较短^[19]。AOC值在25～100 μg Acetate C/L的水样中, 延滞期与对数增长期的时间为2～3 d, 第5 d进入平台期, HPC维持在10⁵数量级。

　　 对数期细菌增长速率如式 (2) 所示, 通过求导计算, 细菌增长速率对初始AOC值的偏导数如式 (5) 所示。

　　 $\begin{array}{l}{C}^{\prime }{}_t(t)=\frac{pC{}_{1}10{}^{p(\text{l}\text{g}t{}_0-t)}\ln 10}{(1+10{}^{p\cdot (\text{l}\text{g}t{}_0-t)}){}^2}(2)\\ \frac{\partial C^{\prime }(t)}{\partial p}=\frac{(1-\ln 10)10{}^{p(\text{l}\text{g}t{}_0-t)}+2\cdot 10{}^{p(\text{l}\text{g}t{}_0-t)}+1}{(1+10{}^{p(\text{l}\text{g}t{}_0-t)}){}^4}(3)\\ \frac{{\partial }^{\prime }C(t)}{\partial p}>0\Rightarrow C^{\prime }{}_t(t)\sim p(4)\end{array}$

　　 如图3所示p与AOC呈负相关, 所以:

　　 $\begin{array}{c}\frac{{\partial }^{\prime }C(t)}{\partial \text{A}\text{Ο}\text{C}}=\frac{{\partial }^{\prime }C(t)}{\partial p}\frac{\partial p}{\partial \text{A}\text{Ο}\text{C}}\hfill \\ \frac{\partial p}{\partial \text{A}\text{Ο}\text{C}}<0,\frac{{\partial }^{\prime }C(t)}{\partial p}>0\hfill \end{array}\}\Rightarrow \frac{{\partial }^{\prime }C(t)}{\partial \text{A}\text{Ο}\text{C}}<0(5)$

　　 在进入对数增长期后, AOC较高的水样本底细菌浓度较高, 代谢消耗大, 所以相比于AOC较低的水样, 其对数增长期的相对增长速度与p值相关, 如式 (5) 所示, 要比AOC较低的水样表现为迟缓, 这与图2中细菌生长曲线的趋势是吻合的。

　　 如图4所示, 进入衰亡期后, HPC变化呈现一致的规律, 但因初始AOC不同表现出了明显的差异性。在第Ⅰ阶段, 细菌大量死亡HPC急剧下降;第Ⅱ阶段, 下降到一定数量后, HPC小幅反弹, 增幅与峰值明显降低;第Ⅲ阶段, HPC再次出现缓慢衰减;第Ⅳ阶段, 再次出现增长, 增幅及峰值较前一次有明显降低的趋势, 趋于稳定。

　　 在AOC为0的水样中, 细菌在贫营养环境下其增长与衰减都变缓, 对AOC的消耗转化低。图4第Ⅱ阶段, 其他水样结束第二次增长衰减周期时, AOC为0的水样第一次增长衰减周期结束后刚进入第二个周期, 其增长动力要优于其他水样, 表现为第29、30、33天HPC高于其他水样。经过长期存放, 水样会趋于稳定, 水样中细菌总数维持在10³数量级范围, 通过对某长期静置密闭存放消防水池测定细菌总数结果与结论吻合。

　　 在生长平台期之后, 水中AOC被细菌充分利用, 外界营养浓度急速下降, 水环境不利于细菌继续生长。当细胞内分解代谢明显超过合成代谢时, 细菌开始出现大量死亡, 进入衰亡期。有的细菌可能因蛋白水解酶活力增强导致菌体自溶并释放代谢产物, 一些芽孢杆菌在此期间可能释放芽孢^[20]。

　　 综合图2与图 4可以发现, 细菌在完成第一个增长衰亡过程后, 表现出了震荡下降的周期性趋势, 可能的原因是:

　　 (1) 营养物质消耗后, 细菌衰亡溶解, 物质被重新利用, 导致细菌出现反复增长衰亡趋势, 由于细菌吸收与溶出AOC的差异性, 使得HPC出现下行趋势。

　　 (2) 土著菌群中, 不同细菌的生长衰亡周期不同, 各个阶段优势种群发生了改变, 部分细菌出现了畸形、变异, 这在HPC平板计数过程中菌落形态、大小、颜色的变化上可以体现。

　　 (3) 与管网水不同, 封闭环境中, 贮存水与外界无物质交换, 初始细菌中AOC与水中AOC符合碳守恒, 细菌代谢排放到水中的毒素、胞外有机物、干扰素等浓度上升, 更加不利于细菌生长。

　　 图5中BRP在AOC 50～75 μg Acetate C/L增幅出现明显上升, 在图2相同区间HPC平台期阶段同样出现这种跃升。Zhang等^[7]对南方供水管网的生物稳定性试验发现, 在细菌生长的平台期AOC与BRP的变化关系呈现了较好的一致性。

　　 进入衰减期后, 以第17天数据为例, AOC与BRP的相关性不再明显, 出现这种情况的原因可能是:由于在实际AOC与BRP测定过程中, 高温灭菌或者巴氏灭菌过程中AOC从细菌体内溶出, 溶出的数量因菌群不同而表现出差异性。当水中细菌含量较低时, AOC与BRP可以表现为较好的相关性, 当本底细菌浓度较高时, 两者相关性较弱。

　　 当初始AOC一定时, 细菌在整个生长期BRP与AOC呈现较好的线性相关关系;当进入衰亡期后, 细菌会因种群的差异性与相互竞争性, 表现为震荡向下的增长、衰亡周期性变化。经过若干周期后, 细菌死亡、自溶释放毒素增加, 变异、贫营养适应能力以及低耗碳能力增强, 变现为AOC与BRP上升, 但两者的相关性关系不再明显。

　　 对于贮存水, 初始AOC一定的条件下, 细菌自身可同化有机碳与初始AOC之和在整个细菌生长变化中遵守碳守恒。对于管网水, 因为有持续AOC源效应, 相对于贮存水, 为维持其生物稳定, 管网水所需消毒剂剂量相对更高。

　　 Prest等^[21]认为水的生物稳定性体现在微生物的群落结构变化, 通过对数增长期时间、平台期高度及持续时间等指标可以进行横向对比。在试验周期内20～50 μg Acetate C/L的水样其整体波动较小, 且进入稳定时间较快, 与Hammes等^[22]提出的32 μg Acetate C/L以及Shar P等^[23]提出的46 μg Acetate C/L (夏季) 与58 μg Acetate C/L (冬季) 的参照标准是相一致的。

　　 基于实际工程考虑, 以NF^[24]、RO^[25]、BAC^[26]等深度处理工艺对AOC的去除效果较好, 但同时也面临着成本的限制。50 μg Acetate C/L用于指导实际工程运用可认为是合理的参考标准。

　　 对细菌生长曲线从初始至平台期进行积分计算, 如式 (6) 所示。

　　 ${\rm I}={\displaystyle {\int }_0^{{\rm T}}C}(t)\text{d}t(6)$

　　 生长期、衰亡期的细菌生长曲线积分分别以I_G与I_D表示, 全周期内积分以I_T表示, 与AOC之间的关系如图 6所示。在细菌对数增长期与平台期, AOC同化生成的细菌总数与AOC值呈现了良好的线性相关, 当进入震荡衰减阶段后, AOC在0～100 μg Acetate C/L内同化的细菌总数与AOC的线性关系弱相关。当将100 μg Acetate C/L以奇异点取出后, 0～75 μg Acetate C/L线性关系良好, 所以可以推测在75 μg Acetate C/L以下, 碳的限制作用明显;当AOC在100 μg Acetate C/L附近时, 碳可能不再是唯一的营养限制因子, 氮和磷^[27,28]对细菌的生长也产生了限制作用。

　　 本文基于乙酸碳标准溶液为模拟水样, 研究了不同低AOC条件下贮存饮用水的细菌生长情况, 发现:

　　 (1) 多菌群的细菌在贮存水中的生长符合迟滞期、对数增长期、稳定期、衰亡期的变化规律, 迟滞期时间与对数增长速率与AOC浓度呈负相关;多菌群的菌落衰亡呈现震荡向下的衰减趋势。

　　 (2) 水中AOC值与BRP在稳定期之前呈现较好的相关性, 进入震荡衰亡期后, 随着菌落种类、胞外有机物的变化, 两者的相关性变弱。

　　 (3) 对于密闭的贮存环境, 细菌中被利用的AOC与水体中的AOC遵守碳守恒。

　　 (4) 基于AOC与菌群生长变化、BRP之间的关系以及实际水处理工艺, 可将50 μg Acetate C/L作为实际工程中生物稳定的参考指标。

　　 (5) AOC在0～75 μg Acetate C/L内碳因子的限制作用明显, 在100 μg Acetate C/L以上氮、磷的综合影响会使得碳因子限制作用减弱。