饮用水和再生水中微生物含量的测定是水质检测的一项重要指标,直接反映水的细菌污染程度,对人体健康和水处理过程优化具有重大意义。目前,饮用水和再生水中微生物含量的测定主要采用异养菌平板计数法(Heterotrophic Plate Count,HPC)^[1,2]。然而自然环境中大部分细菌会随外界条件改变进入“活的不可培养状态”^[3~5],并且检测中容易出现菌落蔓延现象,所以其准确性和真实性仍值得商榷^[6]。相比于传统的HPC,流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)可以分辨水样中的活性细菌和非活性细菌,并且更准确地了解水样中的实际微生物含量^[6,7],但是仪器成本较高,在样品处理和荧光染料的选择方面也存在一定的局限性^[8~10],不适用于现场实时监测。

　　 三磷酸腺苷(ATP)生物发光技术是一种以生物发光反应为基础的快速检测技术^[11],利用细菌ATP量与细菌数成正比这一原理,推算出菌落总数。这种方法不需要培养过程,操作简便,10 min内即可完成^[12~14]。传统的ATP生物发光法测定的是总的ATP(未扣除胞外ATP),同时需要采用适当的富集技术,使样品菌落总数达到有效检测范围^[15]。近年来,Hammes等^[16]利用试剂盒方法优化了该技术,大幅降低其检测限(可达0.000 1nM),并将活菌ATP和胞外ATP进行了区分,同时采用此方法对水环境样品(地表水、地下水、不加氯的给水厂出水及管网水、瓶装水和污水处理厂出水等)中活菌生物量进行了检测,提供了很好的快速活菌检测方法。目前国内已经有一些研究针对瓶装水、桶装水、自动售水机、住宅供水和湖、河水等中的微生物总ATP含量进行检测^[6,17,18,19]。至今为止,关于我国给水厂和再生水厂水样中微生物活菌ATP含量及其去除情况鲜见报道。

　　 本文将优化后的活菌ATP检测方法应用于给水和再生水厂活菌微生物含量的检测,同时采用FCM和传统的HPC方法进行了验证。并利用该方法对不同流域17个给水厂和3个再生水厂进出水中的活菌生物量进行了检测,以期对饮用水和再生水中微生物水质监测和优化水处理工艺提供依据和技术支持。

　　 验证ATP生物荧光法在饮用水和再生水活菌生物量检测中的可行性:取4个给水厂进出水,3个再生水厂进出水,每个水样均进行3 次平行采样。为了减少误差,所有样品都在同一天采集,并在当天进行活菌ATP、FCM和HPC检测。

　　 检测给水厂进出水中的活菌生物量:取长江、黄河、辽河、松花江、黄浦江5 个流域,NJ、ZZ、LZ、JN、ZZ、SY、DL、HEB和SH 9 座城市,17 个给水厂的进出水。每个水厂的进出水均进行3 次平行采样。

　　 检测再生水厂进出水中的活菌生物量:取QD2个再生水厂(8月、11月和12月3次采样),BJ 1个再生水厂进出水,每个水样均进行3 次平行采样。

　　 仪器及试剂:采用GloMax 20/20 (Turner Bio-Systems,Sunnyvale,CA,USA)发光仪和BacTi-ter-GloTM (G8231, Promega Corporation,Dübendorf,CH)试剂盒。

　　 ATP测定方法包括(1)BacTiter-GloTM试剂盒ATP测定方法(G8231,Promega Corporation,Dübendorf,CH),具体参见BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测手册(TB337)。(2)经优化的检测方法^[16],优化参数包括:样品与试剂的体积比由100μL:100μL改为500μL:50μL;反应温度由室温改为38 ℃;反应时间由5min改为20s。其中本研究样品测定采用优化的检测方法,具体方法如下:

　　 (1)ATP标准曲线的绘制。取2mL用无菌超纯水稀释的不同浓度梯度(10^-3~10nM)的ATP标准溶液和50μLATP提取剂,在38℃下加热至少1min;取500μLATP标准溶液加入50μLATP提取剂中,加热20s后立即取出测发光度。所有检测都重复3次取平均值。以ATP浓度为横坐标,生物发光强度为纵坐标,绘制标准曲线。

　　 优化ATP检测方法以ATP标准品的浓度为纵坐标,生物发光强度为横坐标,绘制ATP浓度与生物发光强度的标准曲线,ATP浓度线性范围为10^-3~10nM,相对标准偏差小于5%,R²均为0.98以上,表明ATP浓度与生物发光强度有很好的线性关系。

　　 (2)样品测定。分别用2mL水样(总ATP)和2mL用0.1μm无菌滤膜过滤之后的水样(胞外ATP)代替ATP标准溶液重复以上步骤,得到总ATP和胞外ATP,二者之差即为活菌ATP(nM)。

　　 荧光染色:荧光染料选用SYBR Green I、Pro-pidium iodide(PI)(Invitrogen,USA)。用0.22μm尼龙膜过滤后的二甲基亚砜(DMSO)将SYBR Green I稀释100倍,作为标准使用溶液。取适量与PI(30mmol/L)按50∶1(SYBR Green I∶PI)混合后置于-20℃保存。利用配制的混合染色剂(10μL/mL)给样品染色,室温避光孵化15 min。SYBR Green I/PI染色,可以迅速检测饮用水中的活性细菌/非活性细菌数量,其中活性细菌、非活性细菌的核酸先与SYBR Green I结合,而后非活性细菌核酸又被PI覆盖^[4,6]。

　　 FCM测定:流式细胞仪(BD FACSCalibur,USA),发射波长488nm,采用绝对计数技术来测定200μL体系中颗粒数目,其线性范围为2×10²~1×10⁵个/mL,检测限为200个/mL,绝对计数误差小于5%^[24]。使用流式细胞仪进行测定时,通过调节滤光片收集发射光信号,信号收集软件为Cellquest。绿色荧光(FL1)被设定为触发参数,信号收集波长(520±20)nm,红色荧光(FL3)信号收集波长>615nm。活性细菌产生绿色荧光,非活性细菌产生红色荧光,在Cellquest FL1/FL3二维散点图上可以清楚地将这活性和非活性细菌区分开^[6]。仪器增益设置为FL1=520,FL3=630,采用对数(Log)放大,Speed=3。用鞘液稀释样品以保证测定过程中流式细胞仪计数小于500个/s。

　　 依据国家标准^[20],采用传统的HPC菌落计数方法,即将水样稀释培养(营养琼脂,37℃,48h)并计数。

　　 采用SPSS11.5软件包对ATP生物发光法与FCM、HPC试验结果进行单因素方差分析和线性相关分析。

　　 图1a比较了BacTiter-GloTM试剂盒方法和本文经1.1.1中样品和试剂的体积比、反应时间和温度3个参数优化的ATP检测方法对于ATP标液、某给水厂出水的总ATP和胞外ATP检测的结果,发现优化的ATP检测方法对于ATP标液、总ATP和胞外ATP的荧光值均提高了2~3倍。对给水厂进水、再生水厂进出水样品的总ATP测定也表明优化后的方法检测给水厂进水和再生水厂进出水中活菌ATP时,荧光值也提高了2~24倍(图1b),可大大提高给水厂和再生水厂样品ATP测定的灵敏度和准确性。因此,本研究利用优化的ATP测定方法可以应用于检测给水厂和再生水厂水样的活菌ATP(总ATP-胞外ATP)。

　　 利用ATP生物发光法、FCM和HPC 3种方法检测了给水厂进出水、再生水厂进出水4种水样的活菌ATP浓度、活细胞数和可培养菌落总数,定量结果见表1。图2以某一给水厂出水为例,给出了流式细胞术(SYBR Green I/PI染色)检测饮用水中的活性细菌和非活性细菌数量的示意。给水厂进水中活菌ATP浓度、活细胞数(FCM)和菌落总数(HPC)与国内外文献^[16,21,22]中报道的湖、河中检测结果相近(活菌ATP<1.6nM,菌落总数10⁴CFU/mL左右),给水厂出水中活菌ATP浓度、活细胞数和菌落总数与国内外文献^{[4,6,13,16,23]}报道的给水厂出水、瓶装水、饮水机中检测结果相近(活菌ATP<0.83nM,活细胞数5×10⁴~2×10⁵个/mL,菌落总数1~4CFU/mL)。3种方法检测结果差异均无统计学意义(P>0.05),可作线性相关性分析。以活菌ATP浓度为X轴,以FCM检测的活细胞数为Y轴,作X、Y散点图,描绘两种方法检测活菌生物量的相关性,散点图拟合后有良好的相关性(R²=0.87,P<0.05),见图3。由此证明了ATP生物发光法检测饮用水和再生水中活菌生物量的可行性。由ATP生物发光法和流式细胞术检测结果推算出平均每个细胞活菌ATP浓度为1.39×10^-11nM/个。此结果与国外文献报道相符^{[4,16,24,25,26]}[(0.31~1.37)×10^-16g ATP/个]。

　　 以活菌ATP浓度为X轴,以HPC检测的菌落总数为Y轴,作X、Y散点图,描绘两种方法检测微生物含量的相关性,其相关性较差(R²=0.64,P<0.05),见图4。Siebel等^[27]、Berney等^[4]和Hammes等^[16]亦发现,细胞中ATP的浓度与采用FCM检测细胞时所检测到的细胞数量紧密相关,但与采用HPC所检测的菌落总数却没有得出类似的规律。从表1中可看出,多数情况下HPC检测到的菌落总数比ATP生物发光法和FCM检测到的活细胞数低。Moreno等^[3]研究表明自然环境中绝大部分细菌是无法培养的,当外界压力、温度、营养条件改变时,这些细菌会进入“活得不可培养状态”,此时检测到的细菌可能只占实际微生物量的一少部分。Eawag(瑞士联邦水科学与技术研究院)研究人员发现,采用异养菌平板计数法(HPC)检测水中细菌数量时,所得结果通常比真实值低2 个数量级^[28]。给水厂出水中微生物量很低,可培养的细菌更少,白晓慧等^[23]采用HPC检测上海某给水厂出水中的菌落总数为1~2 CFU/mL。 另外,Kong等^[29]采用ATP生物发光法、FCM和HPC 3 种方法分析了紫外消毒和氯消毒对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和枯燥芽孢杆菌(革兰氏阳性菌)的杀菌效果,结果表明,由于非培养状态的细菌无法用HPC的方法检测到,所以HPC应结合ATP生物发光法或FCM来评估微生物活性。

　　 利用优化的ATP测定方法检测了来自长江、黄河、辽河、松花江、黄浦江5 个流域的水源水,NJ、ZZ、LZ、JN、ZZ、SY、DL、HEB、SH 9 座城市的17个给水厂的进出水中活菌ATP浓度,结果见图5a。由图可知,各水厂活菌ATP去除率为60%~99%,出水的活菌ATP浓度均低于0.05nM,由2.1.2中ATP检测和流式细胞术相关性分析可推测其活细胞数都低于9.47×10⁵个/mL。Delahaye等^[13]采用ATP生物发光法检测了巴黎给水厂及管网中的微生物数量,结果表明3 个水厂出水中ATP浓度分别为0.01nM、0.15nM、0.83nM;Berney等^[4]采用FCM方法检测饮用水、瓶装水和饮水机出水中活细胞数目为10⁵个/mL,与本试验结果相近。

　　 由各流域水源水中的活菌ATP浓度可知,各流域水源水中活菌生物量差异较大。其中,黄浦江流域水源水中最高,活菌ATP浓度最高达1.53nM,由2.1.2中ATP检测和流式细胞术相关性分析可推测其活细胞数为3.08×10⁸个/mL;黄河流域水源水中微生物量最低,活菌ATP浓度最低达0.34×10^-2nM,推测其活细胞数为7.68×10⁵个/mL。

　　 对胞外ATP的测定结果如图5b所示。结果表明,给水厂进水中胞外ATP含量为2%~98%,出水中为2%~97%,且水厂进水中有11%样品的胞外ATP含量高于总ATP的50%,而出厂水中该比例则高达59%。以上结果表明不同水样胞外ATP含量差距较大,给水厂出水样品的胞外ATP含量较高,可能和消毒剂残留有关,需要进一步研究。Hammes等^[16]采用同样方法检测100 个环境样品(瓶装水、泉水、饮用水、淡水)中胞外ATP,也发现其含量为0~97%,其中16%的样品中胞外ATP含量大于50%。因此检测给水厂水样的活菌ATP必须考虑胞外ATP的扣除。

　　 利用优化的方法检测了3个再生水厂进出水中的活菌ATP浓度,其中两个水厂在8月、11月和12月份检测3 次,结果见图6a。由此可知,再生水厂活菌ATP去除率为25%~99%,出水中活菌ATP浓度均低于1.16nM,由2.1.2中ATP检测和流式细胞术相关性分析可推测其活细胞数都为2.34×10⁸个/mL。比给水厂出水活菌生物量高,与其进水中活菌生物量相当,再生水厂微生物处理效果较好。由图6b可知,再生水厂进水中胞外ATP含量为2%~78%,出水中为8%~78%,且43%的水厂进水中胞外ATP含量高于50%,而水厂出水中该比例为86%。Hammes等^[16]采用同样的方法检测两个污水处理厂出水中胞外ATP含量分别约为20%和10%。因此检测再生水厂样品中活菌ATP也必须考虑胞外ATP的扣除。

　　 (1)优化后的ATP生物发光法检测限为0.001nM;与FCM检测的活细胞数相关性良好(R²=0.87),平均每个细胞活菌ATP浓度为1.39×10^-11nM/个,可成功用于饮用水和再生水中活菌生物量的检测。该方法快速、灵敏度高,操作简便,可以和其他方法结合用于水中微生物量的测定,特别是现场实时监测。目前该方法的研究还处于探索阶段,还需要大量数据支撑和深入研究,本研究将为更好地设定水质微生物量的指导值提供数据和技术基础。

　　 (2)发现17个给水厂活菌ATP去除率为60%~99%,出水中活菌ATP占总ATP的3%~98%,其浓度均低于0.05nM,活细胞数均低于9.47×10⁵个/mL,与国内外瓶装水、饮水机水和管网水中的活菌ATP浓度数量级相当。

　　 (3)3个再生水厂中,活菌ATP去除率为25%~99%,进水中活菌ATP含量差异较大,占总ATP的22%~98%,浓度为0.13~1.29nM,出水中活菌ATP占总ATP的22%~92%,浓度均低于1.16nM,推测其活细胞数均低于为2.34×10⁸个/mL。

　　 (4)给水厂和再生水厂水样的胞外ATP含量差距较大(2%~98%),水厂出水中胞外ATP含量较高。 因此检测给水厂和再生水厂样品中活菌ATP必须考虑胞外ATP的扣除。